基于<bold>SSR</bold>标记与农艺性状对三七集团选择群体的评价

李满桥; 王前; 李葵秀; 俎峰; 陈中坚; 王勇; 魏富刚; 杨生超; 刘冠泽; LI Manqiao; WANG Qian; LI Kuixiu; ZU Feng; CHEN Zhongjian; WANG Yong; WEI Fugang; YANG Shengchao; LIU Guanze

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基于SSR标记与农艺性状对三七集团选择群体的评价 PDF

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李满桥 ^1,2,3
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王前 ^1,2,3
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李葵秀 ^1,2,3
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俎峰 ⁴
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陈中坚 ⁵
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王勇 ⁵
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魏富刚 ⁶
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杨生超 ^1,2
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刘冠泽 ^1,2
✉

1. 云南农业大学西南中药材种质创新与利用国家地方联合工程研究中心，昆明 650201； 2. 云南农业大学云南省药用植物生物学重点实验室，昆明 650201； 3. 云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201； 4. 云南省农业科学院经济作物研究所，昆明 650225； 5. 文山学院三七研究院，云南文山 663099； 6. 文山苗乡三七科技有限公司，云南文山 663000

最近更新：2024-10-09

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240131008

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摘要

三七为人参属多年生草本植物，生长和繁育周期长，群体间的遗传多样性低，但群体内单株间表型变异大，人参皂苷含量差异尤为明显。本研究根据三七中5种人参皂苷（三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd）含量构建了11份集团群体（SL1~SL11），对当代和第一代集团群体人参皂苷含量进行了比较分析。同时，基于三七基因组，使用MISA软件进行全基因组水平SSR标记开发，鉴定到255239个SSR标记，筛选出17对多态性SSR标记。使用SSR标记对第一代群体进行遗传多样性评价。结果表明，11份第一代集团群体观察杂合度Ho较高（0.4583~0.6042），遗传分化程度低（Fst=0.0447），且具有较高基因流（Nm=11.6189）；第一代群体间总皂苷含量无显著性差异而三七皂苷R1变异系数高于总皂苷和其他单体皂苷，且群体SL8三七皂苷R1含量显著高于其他群体。综上，本研究以皂苷含量为目标性状构建了高皂苷含量的集团群体，并利用SSR标记评价了群体遗传多样性，构建的三七皂苷R1高含量群体可作为后续育种材料。

关键词

三七; 集团群体; SSR标记; 人参皂苷

三七（Panax notoginseng （BurK.） F. H. Chen）为五加科人参属多年生草本植物，因具有定痛消肿、止血散淤、提高免疫力和保护心脑血管等多种功效被广泛使用^［

1］。三七中三萜皂苷类为主要活性物质，栽培群体个体间单体皂苷组分含量相差3.6~10.2倍，总皂苷含量则相差2.0倍以上^{［参考文献 2

百度学术}2］。三七自然群体中皂苷含量变化及高品质育种一直是三七遗传改良的重点工作。早期研究表明，自然群体个体间性状变异如根的形状、果色、茎色、复叶数、小叶形状等，在居群间和居群内变异明显^{［参考文献 3

百度学术}3］，地下茎（剪口）变异系数达0.433~0.617^{［参考文献 4

百度学术}4］，但居群及群体间的遗传多样性较低，居群间有着较强的基因流动，遗传变异主要发生在居群内个体间。三七群体间遗传多样性低，加大了品种选育难度，加之三七生长年限长、繁殖系数低，生长过程对环境要求苛刻，难以通过单株选择获得纯系材料^{［参考文献 5-6}5-6］。

集团混合选择作为三七品种选育中的主要选择手段，通过地上部分性状与地下部分性状以及皂苷含量的相关性分析，选出优质的群体材料^［

7］。研究发现叶面积对三七单株产量影响较大，高产三七品种选育应提高叶面积，选择宽叶性状。三七中紫根、复叶柄平展、长形根、宽叶等4种性状中皂苷含量高。因此，4种性状类型可作为优质三七品种选育的目标。此外，三七中双茎植株总皂苷含量低于单茎植株，绿茎植株在田间相较于紫茎植株表现出植株高大、产量高、块根大的优良农艺性状，紫茎植株存苗率高于绿茎植株^{［参考文献 8

百度学术}8］。通过三七茎杆颜色，选育出紫茎品种滇七1号和绿茎品种苗乡1号，两个品种产量和皂苷含量均高于自然群体，此后育种家基于三七表型性状通过集团选择选育出多个三七新品种^{［参考文献 9

百度学术}9］。

分子标记在三七种质资源筛选、居群遗传多样性评价和品种选育的应用已有报道^［

10-11］。基于转录组数据开发简单序列重复（SSR，simple sequence repeat）标记，从2361个表达序列标签（EST，expressed sequence tag）中共鉴定出2772个与三萜皂苷合成酶乙酰辅酶A∶2-甲基丙二酰辅酶A转移酶（AACT，Acetyl-CoA∶2-Methylbutyryl-CoA transferase）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR，HMG-CoA reductase）、鲨烯环氧化酶（SE，squalene epoxidase）、鲨烯合酶（SS，squalene synthase）、达玛烯二醇合酶（DS，dammarenediol synthase）基因序列关联的SSR标记^{［参考文献 12

百度学术}12］。张金渝等^{［参考文献 13

百度学术}13］用17对EST-SSR引物对4个不同地区17份三七品系的遗传多样性进行分析，共扩增出136个多态位点，平均多态信息含量（PIC，polymorphic formation content）值为0.78，Nei′s基因多样性0.139，香农信息指数（I，Shannon′s information index）为0.208，品系间遗传分化系数（Fst，the F-Statistic）为0.382。遗传相似度和聚类分析结果表明，17份三七品系和屏边三七被划分为4个大类群，其中17份三七品系被分为3个类群。此后，张金渝等^{［参考文献 5

百度学术}5］利用17对EST-SSR引物对6个三七居群遗传多样性和遗传结构进行比较分析，结果表明三七居群间遗传分化水平低，彼此间具有较高基因流，遗传差异主要存在于居群内。随着三七参考基因组信息的公布，为三七分子标记开发与重要性状的遗传解析奠定了基础^{［参考文献 14-15}14-15］。基于三七基因组序列信息，揭应碧等^{［参考文献 10

百度学术}10］共鉴定到314060个SSR标记，密度为每Mb 131个SSR标记，平均距离为7.62 kb。以滇七1号、苗乡1号和8个自然群体为材料，筛选出多态性标记引物41对。利用筛选出的多态性引物与性状进行关联分析，获得与主根干重、鲜重、主根直径、皂苷含量相关联的8个SSR标记^{［参考文献 16

百度学术}16］。此外，Su等^{［参考文献 17

百度学术}17］基于转录组信息获得与14个农艺性状具有显著关联的15个SSR标记，其中P19-FAM标记与剪口和主根中的三七皂苷R1（NG-R1，notoginsenoside R1）含量显著关联，该位点关联基因为PnDof1。在三七细胞系中过表达该基因，三七皂苷R1和人参皂苷Rg1（G-Rg1，ginsenoside Rg1）、人参皂苷Rb1（G-Rb1，ginsenoside Rb1）、人参皂苷Re（G-Re，ginsenoside Re）、人参皂苷Rd（G-Rd，ginsenoside Rd）含量显著升高，推测该基因可能调控三七中皂苷合成。

通过集团混合选择构建集团群体已育成多个三七品种，但目前尚未以皂苷含量为目标性状构建集团群体用于三七品种选育。本研究根据三七自然群体中不同单株皂苷含量差异构建了11个集团群体，基于已有三七参考基因组信息开发SSR标记，结合农艺性状对集团群体第一代群体进行评价，为后续高皂苷含量材料的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料来自于云南省文山州丘北县（海拔1631 m，北纬23.83°，东经104.10°）。2018年11月，采集成熟3年生三七植株240株，分别测定不同单株主根中5种单体皂苷（三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd）含量。根据主根中总皂苷含量和5种单体皂苷含量高低，构建11份集团群体（SL1~SL11）。于2021年11月，对11份3年生三七集团群体进行综合评价并采集植株叶片用于DNA的提取。

1.2 皂苷含量测定和11份集团群体构建

收集240株3年生三七进行5种皂苷含量测定，精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、三七皂苷R1和人参皂苷Rd对照品适量，加甲醇制成每1 mL含人参皂苷Rg1 0.4 mg、人参皂苷Rb1 0.4 mg、三七皂苷R1 0.1 mg、人参皂苷Re 0.1 mg和人参皂苷Rd 0.2 mg的混合标准品溶液。取3年生三七主根粉末0.6 g，加入甲醇50 mL，称定重量放置过夜，置80 ℃水浴上保持微沸2 h，冷却后称定重量并用甲醇补足重量，摇匀用0.22 µm微孔滤膜滤取滤液。使用高效液相色谱仪（Agilent 1260 Infinity，美国）进行检测，色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6×250 mm，5 µm）（安捷伦科技有限公司，美国），流速为0.7 mL/min，柱温30 ℃，进样体积10 µL。乙腈为流动相A，水为流动相B，按表1中参数进行梯度洗脱，检测波长为203 nm^［

18］。

表1 流动相梯度洗脱程序

Table1 Mobile phase gradient elution procedure

时间（Minutes）

Time

流动相A（%）

Mobile phase A

流动相B（%）

Mobile phase B

0~12

12~60

19~36

81~64

根据总皂苷和单体皂苷含量组合构建集团群体，SL1~SL4由总皂苷含量高于10%的单株构成，SL9~SL11由总皂苷含量低的单株构成，11个集团群体构成见表2。将各群体当代单株种子混收构成第一代集团群体材料。

表2 当代集团群体构建信息

Table 2 Information on contemporary group population construction

群体编号 Population	性状 Traits	皂苷含量范围（%） Range of saponin content	含量平均值（%） Mean
SL1	5种皂苷	12.83~14.13	13.30
SL2	5种皂苷	11.73~12.59	12.13
SL3	5种皂苷	10.87~11.64	11.20
SL4	5种皂苷	10.16~10.77	10.46
SL5	人参皂苷Rg1	4.43~5.62	4.82
SL6	人参皂苷Rb1	4.13~5.10	4.46
SL7	人参皂苷Re	1.49~2.31	1.73
SL8	三七皂苷R1	1.36~2.41	1.97
SL9	5种皂苷	3.78~6.11	4.80
SL10	5种皂苷	3.21~5.81	4.48
SL11	5种皂苷	2.74~4.94	3.66

1.3 集团群体材料性状调查

三七植株性状测定参照《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南　三七》^［

19］，共测定11个植物学性状，包括：总花梗高、茎杆高、中叶长、中叶宽、主根长（钢卷尺和直尺进行测量），复叶柄基茎径、茎中部直径、茎基部直径、主根直径（游标卡尺测量），主根鲜重（电子天平称重），三七叶面积（参考陈中坚等的计算方法^{［参考文献 20

百度学术}20］）。

1.4 三七全基因组SSR标记开发

利用两个版本三七参考基因组PnV1^［

14］和PnV2^{［参考文献 15

百度学术}15］进行全基因组水平SSR分子标记的开发。使用MISA（Microsatellite identification tool，http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）对PnV2版本进行SSR标记开发，选择重复单元为1、2、3、4、5、6个碱基的基序，最小重复数分别为12、6、5、5、5、5。若两个相邻SSR之间的碱基数≤100则定义为复合型SSR。根据SSR标记两端保守序列，利用primer3（http：//primer3. sourceforge.net/）设计标记引物，长度为16~24 bp，PCR产物在80~350 bp之间，其余参数选择软件默认参数。

对筛选获得的标记引物在PnV1和PnV2基因组中进行电子聚合酶链式反应（e-PCR）分析^［

21］，使用Xshell软件进行三七PnV1和PnV2参考基因组e-PCR分析数据创建，建库参数为-w7-f0，利用re-PCR命令在两个版本的基因组中进行e-PCR分析，结合编写perl脚本获得两个版本基因组中仅能扩增1个位点的标记引物，后用筛选出的标记引物在PnV2基因组CDS序列中再进行e-PCR，获得在PnV2版本CDS中可扩增1个位点，两个基因组之间产物长度相差20 bp以上的引物并验证。

1.5 基因组DNA提取及SSR标记验证

用CTAB法提取三七叶片DNA，取0.5 g中叶，充分研磨后加入CTAB抽提液500 μL，65 ℃水浴加热30~60 min。随后加入等体积氯仿∶异戊醇（24∶1）混合液，混匀后12000 r/min离心10 min，取200 μL上清液。加入等体积无水乙醇，静置20 min后10000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入500 μL 75%乙醇 10000 r/min离心5 min，弃去上清液并晾干残留乙醇。用ddH₂O溶解DNA，并通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量^［

22］。PCR反应体系为20 μL，模板DNA 1 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.3 μL（表3），2×Taq Master Mix（诺唯赞，南京）10 μL，用ddH₂O补足至20 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性15 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共30个循环；最后72 ℃末端延伸5 min。使用8%聚丙烯酰胺非变性凝胶对PCR扩增产物进行检测，通过银染法获得扩增条带^{［参考文献 23

百度学术}23］。

表3 多态引物序列信息

Table 3 Polymorphic primer sequence information

引物 Primer	正向引物（5′-3′） Forward primer（5′-3′）	反向引物（5′-3′） Reverse primer（5′-3′）
SSR1	AGTATGTCTCCAACAAGCTCAGG	ATCTTTGAACGAGGTAGCTTCAG
SSR2	GATCGCCGGTTATGTATTTGTAT	TCCTAGTAGTCGTTGCACGTAGA
SSR3	TCCCGAGTATCAACGTATTTGAG	ACGTCAGAATGTTTCAATTTTCG
SSR4	CAAAACTTAATCTGATCACGTCG	TCAGGCAACATCTGAGTTGAATA
SSR5	GCTCTAGTTTGGAATTGCTTTGA	GAGCATTGACCCTATCTTAGCCT
SSR6	TAGCTATTCGTATTTGGTGCCTC	ATTAGAAAAGGAACGCATGGAGT
SSR7	CTAAAATCCTCCATTACCAACCC	GCAAATGCAAAGTTACAAAAGGT
SSR8	CGGTGGCTATCTGCTTGTG	CGCGCGTTTCAGGTTTAT
SSR9	GGTGGTGAAAAGCCCAGA	TGCAGACAGCATAGGAGGC
SSR10	TGAGGTCGACCCAGGAGA	TTTTCGCCAATGACCAGC
SSR11	GTGGCGTGGATGTGTCAA	AAAGGGACCCAAACTCCG
SSR12	GGCAATGTTCAGCCTTGG	ATACTGCCCGTCGGCTTT
SSR13	CACCTTCGGCCTAGCCTC	GAGCGTTATGCGGGTGAC
SSR14	GAATGGTCGAATCACGCC	GCACATGGGGCATCTAGC
SSR15	TCCCAGTTCTCGACAGCC	TGGATTGCTGAATATGCTGG
SSR16	AGTATCATGGCCTCGGCA	CCCATCAGCACCAATTCC
SSR17	AGCCAACATTGCCACCAT	GATTTGCGCCTGCCTAGA
SSR18	TTCTTTATCGGCCCCTCC	GGAAGGCTTCAGGCCACT
SSR19	GGAGCTTGTTGCTGCAGAT	TCATCCGCTCGGTATGCT
SSR20	ATGGCGCAAGCTGTATCC	AGCCACCATGCCACAGAG
SSR21	AAGGCCACGGAAGGGTAA	CATTGAACCCACGCATCA
SSR22	AAGGCTCCGAAGAGAGGTG	TTCGGCCATCTCACGAAT
SSR23	TGCCTGAAAAAGTCCGGT	GGACCTCAAGGTGGCAAA
SSR24	AGTGCAGGTTTTTCGCCA	CTCGAAAGCCTCCCACAA

1.6 数据获取及分析

根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，将有扩增条带的记为1，无增条带的记为0，建立各标记扩增谱带0，1矩阵数据。使用Popgen32软件分析标记引物扩增位点等位基因数（Na，the number of alleles）、有效等位基因数（Ne，the effective number of alleles）、观察杂合度（Ho，observed heterozygosity）、期望杂合度（He，expected heterozygosity）、香农信息指数（I，Shannon′s information index）、多态信息含量（PIC，polymorphic formation content）、遗传分化系数（Fst，the F-Statistic）、基因流（Nm，gene flow）等参数^［

24］。使用Excel和SPSS19.0分析三七的农艺性状，各组间性状的显著性分析采用单因素方差分析（以P≤0.05为显著性差异阈值）^{［参考文献 25

百度学术}25］。

2 结果与分析

2.1 三七全基因组SSR标记开发与验证

从PnV2基因组90336条基因组骨架（Scaffold）中共检测到255239个SSR位点，分布于30605条基因组骨架，其中，有20533条Scaffolds包含1个以上SSR位点（表4）。根据SSR核苷酸重复类型，SSR重复单元从1到6数目分别为17973、183777、45145、4336、2018、1990（图1）。在PnV2基因组中检测到255239个位点，设计182501对标记引物，预扩增20846786个SSR位点，平均每个标记可扩增114.2个位点。其中，e-PCR预扩增共有97396个标记仅能扩增出1个位点，占比53.37%（表4）。

表4 三七基因组SSR标记分布特征

mono-表示单核苷酸重复， di-表示双核苷酸重复，tri-表示三核苷酸重复，tetra-表示四核苷酸重复，penta-表示五核苷酸重复，hexa-表示六核苷酸重复

mono- for single nucleotide repeats， di- for dinucleotide repeats， tri- for trinucleotide repeats， tetra- for tetranucleotide repeats， penta- for pentanucleotide repeats， hexa- for hexanucleotide repeats

图1　不同重复类型SSR基序数量

Fig. 1　SSR number of different repetition types

Table 4 Distribution characteristics of SSR in the genome of P. notoginseng

SSR鉴定 SSR locus identification	统计 Statistics
PnV2基因组检测的序列数目	90336
Number of PnV2 genome sequences examined	90336
PnV2基因组检测到序列的总长度（bp）	1790761764
Total size of detected PnV2 genome sequences	1790761764
PnV2基因组识别到SSR的数量	255239
Total number of SSRs identified in the PnV2 genome	255239
PnV2基因组包含SSR的序列数目	30605
Number of sequences containing SSRs in the PnV2 genome	30605
PnV2基因组包含1个以上SSR的序列数量	20533
Number of sequences containing more than 1 SSR in the PnV2 genome	20533
可通过Primer3设计引物的SSR位点	182501
SSR locus that can be design with primers using primer3	182501
PnV1基因组扩增1个位点的标记	60979
Markers at 1 locus were amplified in the PnV1 genome	60979
PnV2基因组扩增1个位点的标记	97396
Markers at 1 locus were amplified in the PnV2 genome	97396
PnV2基因组CDS中能扩增的标记	1738
Markers capable of amplification in the PnV2 genomic CDS	1738

在PnV1基因组中，97396个标记可预扩增73918个位点，其中有60979个标记可扩增出单个位点，在PnV2 CDS序列中进行e-PCR分析，有1738个标记在PnV2基因组CDS序列中可预扩增2136个位点。其中，有414个标记在PnV1和PnV2基因组中的e-PCR产物具有扩增长度差异，有102个标记的e-PCR产物差异大于20 bp。使用102个标记在11个集团群体中进行聚丙烯酰胺非变性凝胶验证，有60个标记可扩增出条带，扩增效率为58.82%，其中17个标记（SSR8~SSR24）在11份集团群体间具有多态性（图2）。

图2 部分材料SSR2和SSR7聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

Fig. 2 Part of the material polyacrylamide gel electrophoresis detection with primer SSR2 and SSR7

2.2 11份集团群体遗传多样性分析

利用前期研究的7对（SSR1~SSR7）多态性标记引物，以及本次筛选获得的17对（SSR8~SSR24）标记引物（表3），对11份集团群体进行遗传多样性分析。结果表明，24个标记在11份集团群体中可扩增出52个位点，平均每个标记扩增位点2.29个；其中SSR2、SSR5、SSR7、SSR13、SSR15、SSR21、SSR22可扩增出3个位点。24个标记多态信息含量值为0.0468~0.7514，平均多态信息含量值为0.4125，9个标记为高度多态性，10个标记为中度多态性，5个标记为低多态性。平均遗传分化系数（Fst）为0.0447，平均基因流（Nm）为11.6189（表5）。

表5 SSR引物多态性分析

Table 5 Polymorphism analysis of SSR primers

标记 Locus	等位基因数 Na	有效等位基因数 Ne	香农信息指数 I	观察杂合度 Ho	期望杂合度 He	多态信息含量 PIC	遗传分化系数 Fst	基因流 Nm
SSR1	2	1.9555	0.6817	0.6111	0.4906	0.3453	0.0557	4.2380
SSR2	3	2.3082	0.9189	0.5238	0.5690	0.6803	0.0252	9.6529
SSR3	2	1.6101	0.5667	0.4286	0.3804	0.4255	0.0411	5.8398
SSR4	2	1.9969	0.6924	0.7222	0.5012	0.2581	0.0454	5.2570
SSR5	3	1.3987	0.5529	0.3254	0.2862	0.6482	0.0526	4.5022
SSR6	2	1.6602	0.5870	0.3730	0.3993	0.4739	0.0465	5.1209
SSR7	3	2.0259	0.7544	0.5952	0.5084	0.5892	0.0514	4.6172
SSR8	2	1.9938	0.6916	0.8651	0.5004	0.1296	0.0174	14.0928
SSR9	2	1.0080	0.0259	0.0079	0.0079	0.5000	0.0457	5.2250
SSR10	2	1.0322	0.0815	0	0.0314	0.5156	0.0710	3.2716
SSR11	2	1.9989	0.6929	0.9444	0.5017	0.0468	0.0033	76.5634
SSR12	2	1.9898	0.6906	0.5476	0.4994	0.3756	0.0722	3.2113
SSR13	3	1.9834	0.8291	0.5397	0.4978	0.6457	0.0760	3.0391
SSR14	2	1.0241	0.0646	0.0238	0.0236	0.4997	0.1734	1.1917
SSR15	3	2.1450	0.9142	0.3492	0.5359	0.7514	0.0487	4.8872
SSR16	2	1.9756	0.6870	0.6667	0.4958	0.3024	0.0306	7.9234
SSR17	2	1.0080	0.0259	0.0079	0.0079	0.5000	0.0571	4.1250
SSR18	2	1.9980	0.6926	0.6349	0.5015	0.3315	0.0421	5.6928
SSR19	2	1.0322	0.0815	0.0317	0.0314	0.4995	0.0327	7.3913
SSR20	2	1.9999	0.6931	0.8492	0.5020	0.1451	0.0215	11.3966
SSR21	3	2.5067	0.9858	0.8095	0.6035	0.5732	0.0293	8.2778
SSR22	3	2.6127	1.0253	0.9921	0.6197	0.4950	0.0189	12.9441
SSR23	2	1.9955	0.6920	0.9365	0.5009	0.0619	0.0085	29.2042
SSR24	2	1.9955	0.6920	0.8889	0.5009	0.1075	0.0060	41.1890
均值Mean	2.2917	1.8023	0.5966	0.5281	0.3957	0.4125	0.0447	11.6189

11份集团群体遗传多样性分析结果显示，各群体内观察杂合度（Ho）0.4583~0.6042，平均为0.5288；期望杂合度（He）0.3787~0.4392，平均为0.4007；香农信息指数（I）为0.5123~0.6198，平均为0.5708。11份集团群体期望杂合度（He）均小于观察杂合度（Ho），结果表明，11份群体间无遗传分化，但存在较强的基因流（Nm），群体内遗传多样性较高，变异主要存在于集团群体内的单株之间（表6）。

表6 11份集团群体遗传多样性分析

Table 6 Genetic diversity analysis of 11 group populations

群体 Population	等位基因数 Na	有效等位基因数 Ne	香农信息指数 I	观察杂合度 Ho	期望杂合度 He
SL1	2.0833	1.8132	0.5974	0.5128	0.4112
SL2	2.1667	1.7899	0.5945	0.5347	0.4048
SL3	2.0417	1.7513	0.5609	0.5000	0.3873
SL4	2.1250	1.8329	0.6198	0.6042	0.4392
SL5	2.0833	1.7723	0.5767	0.5078	0.3940
SL6	2.0417	1.7936	0.5842	0.6042	0.4167
SL7	1.9167	1.6632	0.5123	0.4583	0.3899
SL8	2.1667	1.7496	0.5808	0.4958	0.3993
SL9	1.9583	1.7339	0.5463	0.5104	0.3944
SL10	2.0000	1.7292	0.5490	0.5472	0.3787
SL11	2.0000	1.7490	0.5564	0.5417	0.3919
均值 Mean	2.0530	1.7616	0.5708	0.5288	0.4007

2.3 集团群体皂苷含量比较分析

对11份集团群体的第一代群体总皂苷和5种单体皂苷含量进行分析，与当代集团群体总皂苷含量进行比较。11份集团群体第一代总皂苷含量为11.60%~15.61%，人参皂苷Rg1含量为4.03%~6.11%，人参皂苷Rb1含量为3.48%~5.80%，人参皂苷Re含量为0.59%~1.23%，三七皂苷R1含量为1.54%~4.96%，人参皂苷Rd含量为0.26%~0.52%。11份集团群体第一代平均总皂苷含量在10%以上。当代群体SL1总皂苷含量为13.30%，SL2为12.13%，SL3为11.20%，SL4为10.46%，第一代SL1群体总皂苷含量为11.60%，SL2为13.87%，SL3为15.61%，SL4为12.87%。与当代群体总皂苷相比，第一代SL2~SL4总皂苷含量提高，但未明显高于第一代SL9~SL11。综上所述，SL1~SL11集团群体第一代群体间，总皂苷含量没有显著差异。

第一代单体皂苷含量比较发现，11份集团群体间具有差异。当代群体SL5人参皂苷Rg1含量为4.82%、SL6人参皂苷Rb1含量为4.46%、SL7人参皂苷Re含量为1.73%、SL8三七皂苷R1含量为1.97%，第一代群体SL5人参皂苷Rg1含量为5.93%、SL6中人参皂苷Rb1含量为5.08%、SL7人参皂苷Re含量为1.16%、SL8 三七皂苷R1含量为4.96%。第一代群体与当代群体相比，SL5群体中人参皂苷Rg1、SL6群体中人参皂苷Rb1、SL8群体中三七皂苷R1含量提高。比较第一代群体单体皂苷含量，发现SL5人参皂苷Rg1含量高于SL6~SL10，低于SL11但差异不明显；SL6人参皂苷Rb1含量低于SL7和SL9，高于其他群体但差异不明显；SL7人参皂苷Re含量明显高于SL8。SL8构建时当代单株总皂苷含量范围在5.34%~8.87%之间，平均值为6.68%，明显低于SL1~SL6，单株三七皂苷R1含量在1.36%~2.41%之间，平均值为1.97%，明显高于SL1之外的群体。当代群体SL1人参皂苷Rd含量明显高于其他群体，但在第一代群体中SL1人参皂苷Rd含量明显低于SL2~SL11，第一代群体SL2~SL11之间人参皂苷Rd含量无明显差异。第一代群体SL8平均总皂苷含量为14.06%，与其他群体没有显著差异，三七皂苷R1平均含量达4.96%，明显高于其余10个群体（图3）。

图3 2018年和2021年11份集团群体材料皂苷含量比较

Fig. 3 Compare with total saponins and monomer saponins in 11 group populations in 2018 and 2021

2018年群体为当代群体，2021年群体为第一代群体

The 2018 groups was the contemporary generation， and the 2021 groups was the first generation

2.4 三七集团群体表型性状比较和性状变异分析

11份集团群体表型性状调查比较发现，茎杆高、茎基部直径、叶长和叶面积等4个性状在群体间无显著差异，总花梗高、复叶柄基茎径、茎中部直径、叶宽、主根长、主根直径、主根鲜重等7个性状群体间差异显著。集团群体差异的性状比较结果表明，SL7和SL11的总花梗显著矮于SL1和SL8，SL3的复叶柄基茎径显著大于SL6、SL7和SL10，SL11茎中部直径显著大于SL6，SL9和SL10的叶宽显著宽于SL2和SL6，SL7主根长显著长于SL4和SL8，SL10和SL11主根直径显著大于SL6，SL10主根鲜重重于SL4和SL6（图4）。

图4 2021年11份集团群体农艺性状评价

Fig. 4 Comparison with agronomic traits among the 11 group populations in 2021

不同小写字母表示群体之间差异显著（P<0.05）

Different lowercase letters indicate significant differences between groups （P<0.05）

利用变异系数，对皂苷含量和11个表型性状进行群体内变异和群体间变异分析。结果表明，集团群体内三七皂苷R1变异系数在32.77%~95.18%之间；叶片长度在群体内的变异小，变异系数在4.69%~13.85%之间。叶部性状和茎部性状与根部性状和皂苷含量相比变异较小，根部性状和皂苷含量在群体内变异幅度大。集团群体间，三七皂苷R1含量的变异与其他性状相比较大，变异系数达44.46%。相较于其他性状，三七皂苷R1含量在群体间和群体内都存在着较大变异（图5）。

图5 三七群体2021年17个性状的变异系数热图

Fig. 5 The heat map of coefficient of variation for 17 traits in the 11 group populations of P. notoginseng

3 讨论

三七品种选育主要通过对目标性状进行混合选择构建集团群体。目前，育种家已利用该方法根据茎杆颜色、高度、复叶柄夹角、总花梗高度、根形、根的颜色等性状选育获得三七新品种^［

9］。但三七新品种依然面临选择效率低、育种周期长等问题，针对皂苷含量的品种选育工作进展尤为缓慢。随着分子标记的开发与应用，张金渝等^{［参考文献 13

百度学术}13］通过EST-SSR引物对17个三七品系进行遗传多样性及遗传分化分析，发现相同栽培居群内筛选出的不同品系存在遗传分化，可用EST-SSR标记检测集团选择结果，提高育种效率。前期研究表明，三七群体内单株间总皂苷含量和单体皂苷含量有着较大差异^{［参考文献 2

百度学术}2］，因此利用分子标记进行群体内皂苷含量的差异单株选择成为研究的重点工作。

本研究基于皂苷含量构建集团群体，用24对SSR多态性分子标记探究不同皂苷含量的集团群体第一代群体的遗传多样性。11份集团群体间观察杂合度（Ho）相近（0.4583~0.6042），且群体的观察杂合度（Ho）均高于期望杂合度（He），表明不同群体内三七基因型分布不平衡，群体内部遗传多样性丰富。Su等^［

17］对92株三七植株，利用41对多态性标记分析样本间遗传多样性，结果表明92个单株间观察杂合度（Ho）为0.5109。本研究中集团群体平均观察杂合度（Ho）为0.5288，与未经驯化的三七栽培群体相近。三七集团群体间遗传分化系数（Fst）为0.0447，与Pan等^{［参考文献 6

百度学术}6］研究中遗传分化系数（Fst）为0.0347的结果相近，表明不同群体之间遗传分化低，遗传分化仅发生在群体内单株之间。同时，从11份集团群体中平均基因流（Nm）为11.6189可知群体间存在较强的基因流动，遗传分化程度低。前人研究也表明，三七居群遗传分化系数（Fst）在0.0016~0.0193之间，居群间几乎没有遗传分化，不同地区居群间的遗传关系较近，各地居群间存在着遗传相似性^{［参考文献 6

百度学术}6］。张金渝等^{［参考文献 13

百度学术}13］使用EST-SSR对经过3代集团选择的育种材料进行遗传分析，表明相同栽培群体内筛选出的不同品系存在一定程度遗传分化。本研究中第一代集团群体分化程度低，杂合度高，推测与三七为常异花虫媒授粉有关。

虽然三七居群间分化程度低，但居群间和居群内有着较为明显的表型变异。11份集团群体之间根部性状变异系数介于7.95%~44.46%之间。此外，第一代集团群体间单体皂苷三七皂苷R1含量相差27倍，群体之间三七皂苷R1变异系数为44.46%，其他单体皂苷群体间的变异系数介于11.85%~26.98%之间，总皂苷的变异系数为7.87%。单体皂苷三七皂苷R1在群体内和群体间均表现出较大的变异，这种差异为针对三七皂苷R1性状选择提供了依据。第一代集团群体SL8表现为三七皂苷R1含量显著高于其他群体，第一代集团群体SL5、SL6、SL7也表现出较高的单体皂苷含量，表明选择三七皂苷R1含量高的单株构建集团的方法可行。而在当代群体构建时，选择单株未考虑单体皂苷之间的比例，可能是当代植株总皂苷含量有显著差异而第一代群体间无显著差异的原因之一。

在SSR引物选择过程中，使用e-PCR在同一物种的不同版本基因组信息中进行预扩增时，如扩增产物长度差异≥3 bp，则该引物可能具备较高的多态性^［

26］。本研究获得在两个版本参考基因组中e-PCR预扩增条带长度相差≥20 bp的102对引物，其中60对引物可扩增出条带，仅17对引物表现出多态性。课题组前期随机选取的200对引物中，有68对能够扩增出条带，41对表现出多态性^{［参考文献 10

百度学术}10］。尽管在引物筛选中e-PCR能够提高正确性，但多态引物比例并未增加，推测引物扩增效率和多态性与基因组组装质量及群体结构有关。三七中SSR分子标记与性状的关联分析可获得与皂苷含量相关联的位点或基因，已有研究通过SSR标记与皂苷含量的关联分析，克隆获得可能调控三七中皂苷合成的基因PnDof1，将该基因在三七细胞系中过表达后细胞系中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd含量显著升高^{［参考文献 17

百度学术}17］。本研究中所得SSR标记未获得性状关联位点和基因，推测与群体构建方式和SSR标记密度相关。因此，后续研究需加强三七基因组水平的多态性SSR标记开发和性状的关联分析研究。通过已构建的SL8群体开发更多三七皂苷R1含量SSR分子标记并开展关联分析。

在与三七同属的人参中，已有相应的SSR分子标记组合可以区分人参品种^［

27］。目前三七也已有多个品种，并且从其转录组和基因组中鉴定出了许多SSR位点^{［参考文献 9-10}9-10］。本研究通过皂苷含量构建集团群体，基于三七基因组开发了SSR标记并对集团群体农艺性状进行遗传评价，为高皂苷育种材料的选择和品种选育提供参考。在后续的研究中，可通过筛选特异的SSR标记或SSR组合来区分不同的三七品种。SSR标记在三七中的开发和应用前景广阔，不仅有助于三七种质资源的保护与利用，还将推动三七育种和产业的可持续发展。

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