花生全基因组变异的鉴定和<bold>InDel</bold>标记的开发及应用

张雪姣; 季木灯; 王丽媛; 李启彪; 徐磊; 江日东; 徐志军; ZHANG Xuejiao; JI Mudeng; WANG Liyuan; LI Qibiao; XU Lei; JIANG Ridong; XU Zhijun

网刊加载中。。。

使用Chrome浏览器效果最佳，继续浏览，你可能不会看到最佳的展示效果，

确定继续浏览么?

复制成功，请在其他浏览器进行阅读

花生全基因组变异的鉴定和InDel标记的开发及应用 PDF

- ORCID：
张雪姣 ¹
✉
- ORCID：
季木灯 ^1,2
- ORCID：
王丽媛 ¹
- ORCID：
李启彪 ¹
- ORCID：
徐磊 ¹
- ORCID：
江日东 ³
- ORCID：
徐志军 ¹
✉

1. 广东省省级现代农业（耕地保育与节水农业）产业技术研发中心/中国热带农业科学院湛江实验站，湛江 524013； 2. 云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201； 3. 湛江市农业科学研究院，广东湛江 524094

最近更新：2024-12-06

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240206001

目录contents

摘要

利用13 个花生品种的重测序数据进行花生全基因组变异鉴定，分析InDel在花生基因组上的分布特点，开发、验证并评估InDel标记在花生亲缘关系和品种鉴定中的效率。结果表明，从13 个花生品种中共检测到313432 个高质量SNP和38777 个高质量InDel，平均分布密度分别为123 个/Mb和15.23 个/Mb；InDel和SNP主要分布于基因间，分别占检测SNP和InDel总数的52.347%和60.081%。利用插入或缺失长度≥10 bp的InDel位点进行标记开发，共有3675 个位点可以进行引物设计，这些位点在花生20 条染色体上分布不均匀，平均分布密度为1.48 个/Mb。e-PCR检测表明，InDel引物扩增位点以1个位点为主，有效引物数为2561 对（69.69%），可检测出3133 个位点，根据引物扩增位点在基因组上的位置信息绘制了扩增位点的物理图谱。在100 对随机引物中，共有31 对在4 个亲缘关系较远的花生品种中存在差异条带，31对引物在47 份花生品种（育种系）中共检测到62 个等位变异，主基因频率范围为0.51~0.98，平均为0.77；多态性信息量范围为0.04~0.37，平均为0.24。聚类分析和群体结构分析均可将47 份花生品种（育种系）分为2 个类群，且结果基本一致；47 份材料最少可用7 个标记进行区分，表明开发的InDel标记可以有效地用于花生遗传多样性的评估和品种鉴定。研究结果丰富了花生的分子标记，为InDel标记在花生资源遗传多样性、品种鉴定、指纹图谱构建等遗传研究中的利用提供了帮助。

关键词

花生; 全基因组变异; InDel; 分子标记; 遗传多样性

花生（Arachis hypogaea L.）是我国重要的油料作物、经济作物、食用和饲料兼用作物，发展花生产业对保证我国食用油安全和供给具有重要意义^［

1］。花生在我国广泛种植，2022 年全国的花生种植面积为4.68×10⁶ hm²，种植面积在国内大宗作物中位居第七，种植业产值仅次于水稻、小麦和玉米，种植效益明显（https：//data.stats.gov.cn/）。随着栽培种花生二倍体祖先种^{［参考文献 2

百度学术}2］（Arachis duranensis，AA和 Arachis ipaensis，BB），四倍体近缘野生种^{［参考文献 3

百度学术}3］（Arachis monticola，AABB）和4个栽培种花生（Tifrunner^{［参考文献 4

百度学术}4］、狮头企^{［参考文献 5

百度学术}5］、伏花生^{［参考文献 6

百度学术}6］和BaileyII^{［参考文献 7

百度学术}7］，AABB）的全基因组数据发布，基于全基因组数据的花生分子标记快速发展，大量的SSR、SNP位点被鉴定出来，并已广泛地应用于花生品种鉴定、种质资源遗传多样性分析、重要性状的QTL定位、基因挖掘和育种研究^{［参考文献 8-11}8-11］。

InDel是基因组序列中发生的小片段的插入或缺失，其分布密度仅次于SNP。利用InDel位点碱基序列差异开发的分子标记，具有变异稳定、准确性高、易于分型、所需检测设备简单和成本低廉的特点，已经被广泛应用于许多作物的遗传研究中。在花生的研究上，Zhuang等^［

5］从52份花生资源的重测序数据中鉴定到1716万个无重复SNP和452万个无重复InDel。王娟等^{［参考文献 12

百度学术}12］通过对169 份花生核心种质进行简化基因组测序鉴定到10401个InDel，发现仅有少数分布在功能基因相关区域。刘宇等^{［参考文献 13

百度学术}13］利用13个多态性InDel标记检测4个具有典型生物学类型的90份中国花生地方品种材料，共检测出43个等位变异，标记的多样性指数平均为0.443，可以有效揭示栽培种花生的遗传变异。陶顺玉等^{［参考文献 14

百度学术}14］利用2个含油量差异显著的亲本徐花13和中花6号的三代测序数据，开发了84个位于含油量QTL区间的InDel标记，使用其中的9个标记对近等基因系群体进行基因分型，通过连锁分析将含油量QTL定位到1.2 Mb区间。黄莉等^{［参考文献 15

百度学术}15］利用InDel标记加密，将根部结瘤QTL qPNA08和qPNB07的区间分别由4.7 Mb和9.9 Mb缩小至1.6 Mb和1.8 Mb，两个QTL的遗传变异解释率分别由9.1%和7.1%增加至16.4%和9.9%，证实了利用InDel标记进行QTL定位的可行性。这些研究表明花生基因组中存在着丰富的InDel变异，基于InDel位点的分子标记在花生的遗传研究中具有丰富的应用场景。然而到目前为止，可利用的花生InDel标记的数量还十分有限，基于花生全基因组InDel位点的分子标记开发还未见报道，限制了花生InDel标记在花生品种鉴定和遗传研究中的应用。因此，本项目拟利用13个花生品种的全基因组重测序数据，鉴定全基因组变异，分析SNP和InDel变异在基因组上的分布规律，开发易于检测的InDel标记，同时利用随机挑选的InDel标记对8份亲缘关系较远的花生品种和39份亲缘关系较近的育种系进行遗传多样性分析、群体结构分析和指纹图谱构建，以此评估开发的InDel标记在花生资源鉴定和遗传研究中的效率，研究结果将进一步丰富花生的分子标记，同时为InDel标记在花生品种鉴定、资源评价和QTL定位等遗传研究上的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 基因组数据

13个花生品种的重测序数据来源于NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），品种信息和数据库编号如表1所示。

表1 13个重测序花生品种的信息和数据编号

Table 1 Information and genome resequencing data accessions of 13 peanut cultivars

序号 No.	品种名称 Cultivar name	来源 Origin	重测序数据编号 Resequencing data accession
1	狮头企	中国广东省澄海县	SRR7617991
2	伏花生	中国山东省烟台市	SRR8433136
3	小白沙	中国广东省澄海县白沙农场	SRR8439009
4	鲁花11	中国莱阳农学院	SRR8441995
5	海花1号	中国山东省花生研究所	SRR8441996
6	汕油27	中国汕头市农业科学研究所	SRR8442014
7	中花16	中国农业科学院油料作物研究所	SRR8442017
8	闽花6	中国福建农林大学作物科学学院	SRR8442644
9	豫花23	中国河南省农业科学院经济作物研究所	SRR8442723
10	Sunoleic95	美国	SRR8446494
11	四粒红	中国辽宁省	SRR8447032
12	远杂9102	中国河南省农业科学院经济作物研究所	SRR8759104
13	徐州68-4	中国江苏省徐州地区农业科学研究所	SRR8759105

1.2 全基因组变异鉴定

从花生数据库（https：//peanutbase.org/）中下载Tiffrunner基因组Version 2.0作为参考基因组，使用Fastp软件^［

16］对测序数据进行质控获得Clean reads，使用BWA软件（https：//bio-bwa.sourceforge.net/）中的mem程序将质控后的数据比对到花生参考基因组，然后使用samtools软件（https：//www.htslib.org/）进行数据格式转换，排序并去除标记PCR重复序列。使用GATK软件（https：//gatk.broadinstitute.org/hc/en-us）中的HaplotypeCaller进行变异检测，按照“QD<2.0 || MQ<40.0 || FS>60.0 || SOR>3.0 || MQRankSum<-12.5 || ReadPosRankSum<-8.0”进行质控。使用SnpEff软件（https：//pcingola.github.io/SnpEff/）对获得的变异进行注释和统计。

1.3 InDel标记开发

对获得的InDel位点按照插入或缺失≥10 bp的标准进行筛选，对筛选后的位点使用Primer3.0 软件进行引物设计。

1.4 引物质量检测

使用 e-PCR Version： 2.3.9 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/epcr/）对设计的引物进行电子PCR 检测，参数设置按照Deng等^［

17］方法进行。分析InDel标记在栽培种花生（Tifrunner）全基因组中的扩增情况，统计并记录引物在基因组上的扩增次数，剔除扩增产物长度小于100 bp或大于500 bp 及扩增位点超过3个的引物。使用Tbtools^{［参考文献 18

百度学术}18］软件对扩增位点在基因组上的位置进行可视化。

1.5 InDel标记的通用性检验和花生资源的遗传多样性分析

从e-PCR检测质量合格的InDel引物中，在每条染色体上随机挑选5对引物，共挑选了100 对引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20240206001，附表1）。47份花生品种（或育种系）的信息如表2所示，中花10号、ICG12625、四粒红、远杂9102、花育 51、中花16、花育60和濮科花4号为本单位收集的亲缘关系较远的品种；其余39个为本单位选育的亲缘关系较近的花生育种系，其中27个是以豫花40为母本、ICG12625为父本选育的育种系。将47份花生品种（育种系）种植于温室中的营养钵内，待种子萌发长出三片叶时，取花生幼嫩叶片，采用改良CTAB法提取DNA，利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和纯度，于-20℃保存备用。PCR反应体系和PCR程序按照Huang等^［

8］方法。首先利用中花10号、ICG12625、远杂9102和四粒红对100 对引物进行筛选，然后利用筛选出的多态性引物对47份花生品种（育种系）进行检测，PCR产物使用2.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，电压60 V，电泳120 min，使用凝胶成像系统拍照保存。带型统计按照第一条带纯合记为1/1，第二条带纯合记为2/2，杂合带记为1/2，缺失记为-，所有缺失条带进行3次独立PCR验证。使用Powermarker软件（https：//brcwebportal.cos.ncsu.edu/powermarker/downloads.htm）根据全部品种的带型统计数据计算主等位基因频率、等位基因数、基因多样性、杂合性、多态性信息含量（PIC， polymorphic information content）和遗传距离。遗传距离利用Powermarker软件中的“share allele”法进行计算，然后使用MEGA 7.0软件根据遗传距离采用邻接法进行聚类。利用Structure 2.3.4软件（https：//web.stanford.edu/group/pritchardlab/structure_software/release_versions/v2.3.4/html/structure. html）进行群体结构分析，通过计算ΔK值分布确定最佳群体组群数，使用Tbtools软件^{［参考文献 18

百度学术}18］进行可视化。利用SNPT软件（http：//www.shigatox.net/stec/cgi-bin/snpt）筛选最优标记组合，构建指纹图谱。

表2 47份花生品种（育种系）的基本信息

Table 2 Basic information of 47 peanut cultivars （breeding-lines）

编号 No.	名称 Name	来源 Origin	亲本 Parents	编号 No.	名称 Name	来源 Origin	亲本 Parents
1	中花10号	中国农业科学院油料作物研究所	四会大株× 86-14007	25	YI6H1	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625
2	ICG12625	中国农业科学院油料作物研究所	-	26	YI6H23G2	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625
3	四粒红	吉林省农业科学院	-	27	热花18	中国热带农业科学院湛江实验站	中花10×18
4	远杂9102	河南省农业科学院	白沙1016×A. chacoense	28	YI6H21	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625
5	花育51	山东省农业科学院	P76×鲁花15号	29	YI6H30K	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625
6	中花16	中国农业科学院油料作物研究所	8130×中花5号	30	YI6H21	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625
7	YI6H29	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625	31	YI6H13	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625
8	H51R	中国热带农业科学院湛江实验站	H15002（自然突变）	32	YI6H22K	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625
9	YI6H2F	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625	33	YI6H61	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625
10	YI6H2H	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625	34	YI6H62	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625
11	YI6H621	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625	35	YI6H63	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625
12	YI6H16	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625	36	YI6H611	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625
13	TS23H21	中国热带农业科学院湛江实验站	四粒红（自然突变）	37	YI6H26H	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625
14	热花57	中国热带农业科学院湛江实验站	中花10号×57	38	热黑1号	中国热带农业科学院湛江实验站	中花10号×157
15	JH67H	中国热带农业科学院湛江实验站	冀花7号（诱变）	39	RH12	中国热带农业科学院湛江实验站	热红1号（诱变）
16	YI6H13	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625	40	热红1号	中国热带农业科学院湛江实验站	25-6（诱变）
17	YI6H62	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625	41	花育60	山东省农业科学院	开农49×E16
18	JH67-1	中国热带农业科学院湛江实验站	冀花7号（诱变）	42	僕科花4号	濮阳市农业科学院	豫花11号×濮9321
19	YI6H1-2	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625	43	YI6H25	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625
20	热花144	中国热带农业科学院湛江实验站	中花10号×144	44	YI6H22	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625
21	YI6H23G	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625	45	YI6H111	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625
22	RT1	中国热带农业科学院湛江实验站	冀花甜2号（诱变）	46	YI6H1X1	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625
23	RH11	中国热带农业科学院湛江实验站	热红1号（诱变）	47	YI6H1X2	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625
24	YI6H131	中国热带农业科学院湛江实验站	豫花40×ICG12625

- 表示种质资源的亲本未知

- indicates that the parents of germplasm resources are unknown

2 结果与分析

2.1 花生全基因组变异的鉴定和分布特点

13个花生品种的重测序数据经过滤质控后比对到花生参考基因组，测序深度均超过10×，平均比对率为96.74%，表明13个品种的测序质量良好。经过严格的质控和检测，分别获得313432和38777个高质量SNP和InDel位点，SNP和InDel位点在基因组上的密度和分布如图1所示。SNP在基因组上的平均密度为123个/Mb，其中73.80%（231311个）为转换（Ts， transitions，G/A和C/T），26.20%（82121个）为颠换（Tv， transversions，A/C、A/T、C/G和G/T），Ts/Tv比为2.82（图2A）。InDel在基因组上的平均密度为15.28个/Mb，其中53.94%（20915个）为插入型，46.06%（17862个）为缺失型；InDel的长度主要（96.74%）分布在1~20 bp之间，随着插入或缺失的核苷酸增多，数量逐渐减少，其中单个核苷酸插入或缺失的InDel数量最多，占总数的58.40%（22548个）（图2B）。根据参考基因组的基因结构和注释，InDel和SNP主要分布于基因间，分别占52.347%（33473个）和60.081%（286276个）；其次是上游基因和下游基因序列内，分别占36.122%（23098个）和32.492%（154818个）；小部分位于基因内含子区，分别占7.898%（5050个）和4.367%（20806个）；在外显子上共检测到761 个InDel（1.190%）和8741 个SNP（1.183%）（图3）。

图1 花生全基因组变异的分布

Fig. 1 Density and distribution of peanut SNP/InDel markers on each chromosome of peanut

A和B分别表示SNP和InDel在花生基因组上的分布密度曲线，按照1 Mb滑动窗口进行统计；C~E分别表示全部InDel、插入型和缺失型InDel在花生基因组上的分布，按照10 Mb滑动窗口进行统计

A and B represent the distribution density curves of SNP and InDel loci on peanut genome respectively， according to the 1 Mb sliding windows；C-E represent the distribution of InDel markers， delete type markers and insert type markers on chromosomes respectively， according to the 10 Mb sliding windows

图2 SNPs/InDels分类和数量

Fig. 2 SNPs/InDels classification and number

A： SNP的转换和颠换的类型和数量；B： InDel核苷酸长度和数量

A： Type and number of transition and transversion of SNPs； B： InDel length and number of nucleotides

图3 结构变异发生在基因组不同区域的比例

Fig. 3 Proportion of structural variation occurring in different regions of the genome

A和B分别表示InDel和SNP在基因组不同区域的比例和数量

A and B represent the proportion and quantity of InDel and SNP in different regions of the genome，respectively

2.2 InDel标记的开发

对获得的38777个InDel位点按照插入或缺失长度≥10 bp进行筛选，共选出4082个InDel，对筛选出的InDel位点进行引物设计，发现共有3675 个InDel位点可以进行引物设计。可设计引物的InDel位点在20条染色体上分布不均匀，其中Chr.20染色体上分布最多，为233个；缺失型InDel共2606个（70.90%），分布范围为64（Chr.02）~190个（Chr.19）；插入型InDel共1069个（29.10%），分布范围为38（Chr.08）~77个（Chr.20）；分布密度范围为1.08（Chr.02）~2.45个/Mb（Chr.08），平均1.48 个/Mb（表3）。

表3 可进行引物设计的InDel位点在染色体上的数量统计

Table 3 Statistics of primer design InDel loci on chromosomes

染色体 Chromosome	InDel标记 InDel Marker			标记平均密度（个/Mb） Average marker density
染色体 Chromosome	缺失型 Insert type	插入型 Delete type	合计 Total	标记平均密度（个/Mb） Average marker density
Chr.01	97	45	142	1.26
Chr.02	64	48	112	1.08
Chr.03	150	63	213	1.49
Chr.04	148	60	208	1.61
Chr.05	130	54	184	1.58
Chr.06	151	47	198	1.66
Chr.07	90	43	133	1.63
Chr.08	88	38	126	2.45
Chr.09	109	44	153	1.27
Chr.10	106	42	148	1.26
Chr.11	125	70	195	1.31
Chr.12	124	54	178	1.48
Chr.13	119	48	167	1.14
Chr.14	150	55	205	1.43
Chr.15	165	65	230	1.44
Chr.16	148	53	201	1.33
Chr.17	158	51	209	1.56
Chr.18	138	53	191	1.41
Chr.19	190	59	249	1.56
Chr.20	156	77	233	1.61
合计 Total	2606	1069	3675	1.48

2.3 InDel标记质量检测

以栽培种花生Tifrunner基因组为模板进行电子PCR检测，结果表明InDel标记在花生基因组上具有较高的扩增效率，2834对（77.12%）引物在基因组上可以扩增出6005个位点，扩增片段长度在39~599 bp之间，扩增的位点主要以1个位点为主（57.31%），其次是2个位点（9.20%）（表4）。扩增位点数为1~3的引物为有效引物，共2561对（69.69%），可检测出3133个（52.71%）有效位点，其中1045对（40.80%）引物仅能在A亚基因组（Chr.01~Chr.10）上扩增，1253对（48.93%）引物仅能在B亚基因组（Chr.11~Chr.20）上扩增，263对（10.27%）引物在A和B亚基因组上均能扩增。根据有效扩增位点在基因组上的位置，绘制了InDel标记扩增位点图谱，为InDel标记扩增位点的基因组位置信息提供参考（图4）。

表4 InDel引物e-PCR扩增位点统计

Table 4 Statistics of InDel primers amplified in peanut genome by e-PCR

DNA 模板

DNA template

扩增位点数

Amplified loci number

有效扩增

位点数

Effective amplified loci number

扩增引物数

Number of amplified primers

引物扩增位点统计

Primer amplified loci statistics

有效引物数

Number of effective primer pairs

Tifrunner^a

6005

3133

（52.17%）^b

2834

（77.12%）^c

2106

（57.31%）^d

338

（9.20%）^d

117

（3.18%）^d

273

（7.43%）^d

2561

（69.69%）^e

^a表示DNA模板使用的是Tifrunner的基因组；^b表示扩增产物长度为100~500 bp位点在所有扩增位点中的比例；^c表示能够扩增出条带的引物在全部引物中的比例；^d表示扩增位点数为1、2、3和>3的引物在全部引物中的比例；^e表示有效引物在全部引物中的比例

^arepresents the DNA template used genome of Tifrunner；^b represents the proportion of sites with 100-500 bp amplification product length in all amplification sites；^c represents the proportion of primers that could amplify products in all the primers；^d represents the proportion of primers with amplification site number 1， 2， 3 and more than 3 in all primers；^erepresents the proportion of effective primers in all the primers

图4 部分InDel标记在花生基因组上的扩增位点图谱

Fig. 4 Physical map of amplified loci of part InDel markers in peanut genome

2.4 InDel标记多态性的验证

从开发的2561个InDel标记中随机挑选100对引物，对中花10号、ICG12625、远杂9102和四粒红4个亲缘关系较远的花生品种进行PCR扩增，结果表明100对引物均可扩增出清晰的条带，其中31对引物在4个品种间扩增出差异条带，差异引物均扩增出2个条带，说明开发的引物具有较好的扩增效率和分辨率。利用筛选的31个多态性InDel标记对47份花生品种（育种系）进行检测，结果表明31个InDel标记的多态性存在差异（图5，表5）。31个标记共检测到62个等位变异，每个标记可检测到2~3种基因型；主基因频率范围为0.51~0.98，平均为0.77；基因多样性范围为0.04~0.50，平均为0.30；杂合度范围为0~0.58，平均为0.11；多态性信息量范围为0.04~0.37，平均为0.24。

图5 部分InDel标记在47个花生品种（育种系）中的扩增情况

Fig. 5 Amplification of part InDel markers in 47 peanut cultivars （breeding-lines）

M：DNA Marker；1、10、20、30、40表示47个花生品种（育种系）的编号，同表2

1，10，20，30 and 40 represent number of the 47 peanut cultivars （breeding-lines），as shown in table 2

表5 31个InDel标记的遗传参数

Table 5 Genetic parameters of 31 InDel markers

标记 Marker	主基因频率 Major allele frequency	等位基因数Allele number	基因型数Genotype number	基因多样性 Gene diversity	杂合度 Heterozygosity	多态性信息量 Polymorphic information content
InDA01M0046	0.61	2	2	0.48	0	0.36
InDA01M0057	0.56	2	3	0.49	0.13	0.37
InDA02M0012	0.51	2	3	0.50	0.19	0.37
InDA02M0032	0.55	2	3	0.49	0.17	0.37
InDA03M0011	0.95	2	2	0.09	0	0.08
InDA03M0022	0.90	2	3	0.18	0.07	0.16
InDA03M0034	0.95	2	2	0.09	0	0.08
InDA04M0001	0.98	2	2	0.04	0	0.04
InDA04M0053	0.96	2	2	0.08	0	0.08
InDA05M0025	0.65	2	3	0.46	0.11	0.35
InDA06M0001	0.94	2	3	0.10	0.02	0.10
InDA06M0020	0.68	2	3	0.44	0.2	0.34
InDA08M0007	0.95	2	3	0.09	0.05	0.08
InDA08M0058	0.86	2	3	0.24	0.02	0.21
InDA09M0002	0.59	2	3	0.48	0.22	0.37
InDA10M0033	0.88	2	3	0.21	0.07	0.19
InDA11M0029	0.90	2	3	0.17	0.06	0.16
InDA16M0148	0.96	2	2	0.08	0	0.08
InDA20M0036	0.72	2	3	0.40	0.13	0.32
InDA01M0001	0.65	2	3	0.45	0.12	0.35
InDA02M0043	0.51	2	3	0.50	0.26	0.37
InDA05M0013	0.96	2	2	0.08	0	0.08
InDA10M0002	0.87	2	3	0.23	0.24	0.21
InDA10M0018	0.70	2	2	0.42	0	0.33
InDA12M0101	0.51	2	3	0.50	0.31	0.37
InDA18M0002	0.70	2	2	0.42	0	0.33
InDA18M0018	0.55	2	3	0.50	0.58	0.37
InDA18M0045	0.89	2	2	0.20	0	0.18
InDA19M00161	0.96	2	2	0.08	0	0.08
InDA19M0190	0.81	2	3	0.31	0.11	0.26
InDA20M0002	0.57	2	3	0.49	0.39	0.37
平均 Average	0.77	2.00	2.65	0.30	0.11	0.24

2.5 花生品种（或育种系）聚类分析、群体结构分析和指纹图谱构建

基于遗传距离的聚类分析表明，利用3个InDel标记可以有效地将4份材料区分开。在遗传距离为0.25时，可将47份花生品种（育种系）分为两个类群，其中类群I共有31份材料，包括花育51、中花16、远杂9102、ICG12625和四粒红5份品种和26份育种系；类群II包含16份材料，包括中花10号、濮科花4号和花育60 三份品种及13个育种系（图6A）。以ICG12625为父本的27 份育种系，有17份与ICG12625聚在类群I，1份位于类群II，表明InDel标记可以有效区分亲缘关系较近的花生材料。群体结构分析表明，随着K值增加，LnP（D）持续增加，无明显拐点；ΔK在K=2时为最大值，表明47份材料的最佳分群为2个类群，分别包含32份材料和15份材料，群体结构分析结果与聚类结果基本一致（图6B、C）。利用SNPT软件进行标记筛选发现，最少用7个标记（InDA01M0001、InDA01M0046、InDA02M0012、InDA06M0020、InDA09M0002、InDA12M0101、InDA20M0002）就可将47份材料区分开，表明InDel标记具有较高的分辨率。利用这些标记构建了47份的材料的InDel指纹图谱（图7）。

图6 47个花生品种（育种系）的聚类分析和群体结构分析

Fig. 6 Cluster analysis and population structure analysis of the 47 peanut cultivars （breeding-lines）

A： 47个花生品种（育种系）的聚类图， 1~47表示47个花生品种（育种系）的编号，同表2，下同；B： ΔK和LnP（D）的变化趋势；C： 47个花生品种（育种系）在K=2时的群体结构

A：The cluster tree of 47 peanut cultivars （breeding-lines）， 1-47 represent the number of 47 peanut cultivars （breeding-lines），as shown in table 2，the same as below； B： The distribution of ΔK and LnP（D）； C： The population structure of the 47 peanut cultivars （breeding-lines） with the K value of 2

图7 47个花生品种（育种系）的InDel指纹图谱

Fig. 7 The fingerprint of the 47 peanut cultivars （ breeding-lines）

绿色圆点表示基因型1/1；红色圆点表示基因型2/2；空白圆点表示杂合基因型1/2；灰色圆点表示无条带缺失型

The green dot represents genotype 1/1； The red dot represents genotype 2/2； The blank dot represents the heterozygous genotype 1/2； The gray dot represents the no banding and no genotypes detected

3 讨论

分子标记是开展作物遗传研究和高效育种的重要工具，自Tifrunner^［

4］、狮头企^{［参考文献 5

百度学术}5］等9 个花生基因组公布以来，大量基于花生全基因组的序列变异被鉴定出来并用于分子标记开发，主要表现在花生SSR位点的鉴定和开发上。Luo等^{［参考文献 19

百度学术}19］从野生花生基因组A. duranensis 和A. ipaensis中分别鉴定了264135个和392107个SSR位点，利用鉴定的位点开发了84383个和120056个SSR标记。Lu等^{［参考文献 20

百度学术}20］从栽培种花生伏花生基因组中鉴定了8329496个SSR位点，并开发了973394个新的SSR标记，其中44.15%可以实际检测到。徐志军等^{［参考文献 21

百度学术}21］从花生的全转录组数据中鉴定到19143个SSR位点，开发了5859个转录组SSR标记。王玉龙等^{［参考文献 22

百度学术}22］从四倍体野生花生基因组中鉴定了676878个SRR位点，设计了192303对SSR引物，极大地丰富了花生的分子标记。但SSR标记的多态率通常在10%~30%之间，带型复杂，读带困难，需要借助聚丙烯酰胺凝胶电泳或者价格昂贵的毛细管电泳检测进行基因分型。与SSR标记相比，InDel 标记在基因组中分布广、密度大，丰富性远高于SSR，且具有多态性高、稳定性好、分型简单的特点。本研究利用13个花生品种重测序数据进行了全基因组变异检测，共鉴定到313432个和38777个高质量SNP和InDel位点，利用插入或缺失≥10 bp的3675个InDel位点首次在全基因组水平上进行了InDel引物设计和标记质量检测，获得了2561个InDel标记，进一步丰富了花生分子标记，为基于分子标记的遗传研究提供了可利用的资源，且所开发的InDel标记主要为1~3个扩增位点，特异性高，易于分型，具有较好的准确性。

在花生研究上，InDel标记多应用于QTL的精细定位中，如种皮色^［

23］、开花习性^{［参考文献 24

百度学术}24］、根部结瘤性状^{［参考文献 15

百度学术}15］和含油量^{［参考文献 14

百度学术}14］QTL的精细定位，而在花生品种鉴定和遗传多样性方面的研究还较少。本研究从100对随机合成引物中筛选到31对多态性引物，在47个花生品种（育种系）中共检测到62个等位变异；主基因频率范围为0.51~0.98，平均为0.77；基因多样性范围为0.04~0.50，平均为0.30；杂合度范围为0~0.58，平均为0.11；多态性信息量范围为0.04~0.37，平均为0.24，表明47个花生品种（育种系）的遗传多样性较低，这可能与本研究中使用了39 份亲缘关系较近的育种系有关。白冬梅等^{［参考文献 25

百度学术}25］利用90对SSR引物对72 份山西地方种质进行检测，共检测到317个等位变异，变化范围为2~8个，SSR位点的主基因频率变化幅度为0.29~0.90，平均为 0.68；基因多样性指数变化幅度为0.18~0.77，平均为0.45；多态性信息量变异范围为0.17~0.74，平均为0.40。与SSR标记相比，InDel标记由于扩增位点较少，基因多样性和多态性信息量较低，刘宇等^{［参考文献 26

百度学术}26］利用21个花生品种进行InDel标记筛选也有类似发现。聚类分析和群体遗传结构分析能反映材料间基因交流和渗入情况，能更好地说明材料间的遗传结构，有助于育种者准确地掌握种质间的遗传关系。本研究中8个品种和39个育种系可聚为2个类群，聚类结果与群体结构分析结果基本一致，来源于ICG12625的27个育种系分布在2个类群中，促进了对这些育种系的分子评估。在遗传研究中，亲缘关系较近的材料通常难以区分，在本研究中InDel标记在亲缘关系较近的材料中也表现出较好的多态性，且利用7个InDel标记就可区分全部材料，为利用InDel标记鉴定亲缘关系较近的花生材料提供了依据。综上所述，InDel标记在研究花生品种的遗传多样性和品种鉴定方面均具有较高的效率，可以广泛应用于花生的遗传研究。

参考文献

廖伯寿. 我国花生生产发展现状与潜力分析. 中国油料作物学报， 2020， 42 （2）： 161-166 [百度学术]

Liao B S. A review on progress and prospects of peanut industry in China. Chinese Journal of Oil Crop Sciences， 2020， 42 （2）： 161-166 [百度学术]

Bertioli D J， Cannon S B， Froenicke L， Huang G， Farmer A D， Cannon E K， Liu X， Gao D， Clevenger J， Dash S， Ren L， Moretzsohn M C， Shirasawa K， Huang W， Vidigal B， Abernathy B， Chu Y， Niederhuth C E， Umale P， Araújo A C， Kozik A， Kim K D， Burow M D， Varshney R K， Wang X， Zhang X， Barkley N， Guimarães P M， Isobe S， Guo B， Liao B， Stalker H T， Schmitz R J， Scheffler B E， Leal-Bertioli S C， Xun X， Jackson S A， Michelmore R， Ozias-Akins P. The genome sequences of Arachis duranensis and Arachis ipaensis， the diploid ancestors of cultivated peanut. Nature Genetics， 2016， 48（4）： 438-446 [百度学术]

Yin D， Ji C， Ma X， Li H， Zhang W， Li S， Liu F， Zhao K， Li F， Li K， Ning L， He J， Wang Y， Zhao F， Xie Y， Zheng H， Zhang X， Zhang Y， Zhang J. Genome of an allotetraploid wild peanut Arachis monticola： A de novo assembly. Gigascience， 2018， 7（6）： giy066 [百度学术]

Bertioli D J， Jenkins J， Clevenger J， Dudchenko O， Gao D， Seijo G， Leal-Bertioli S C M， Ren L， Farmer A D， Pandey M K， Samoluk S S，Abernathy B， Agarwal G， Ballén-Taborda C， Cameron C， Campbell J， Chavarro C， Chitikineni A， Chu Y， Dash S， Baidouri M E， Guo B， Huang W， Kim K D， Korani W， Lanciano S， Lui C G， Mirouze M， Moretzsohn M C， Pham M， Shin J H， Shirasawa K， Sinharoy S， Sreedasyam A， Weeks N T， Zhang X， Zheng Z， Sun Z， Froenicke L， Aiden E L， Michelmore R， Varshney R K， Holbrook C C， Cannon E K S， Scheffler B E， Grimwood J， Ozias-Akins P， Cannon S B， Jackson S A， Schmutz J. The genome sequence of segmental allotetraploid peanut Arachis hypogaea. Nature Genetics， 2019， 51（5）： 877-884 [百度学术]

Zhuang W， Chen H， Yang M， Wang J， Pandey M K， Zhang C， Chang W C， Zhang L， Zhang X， Tang R， Garg V， Wang X， Tang H， Chow C N， Wang J， Deng Y， Wang D， Khan A W， Yang Q， Cai T， Bajaj P， Wu K， Guo B， Zhang X， Li J， Liang F， Hu J， Liao B， Liu S， Chitikineni A， Yan H， Zheng Y， Shan S， Liu Q， Xie D， Wang Z， Khan S A， Ali N， Zhao C， Li X， Luo Z， Zhang S， Zhuang R， Peng Z， Wang S， Mamadou G， Zhuang Y， Zhao Z， Yu W， Xiong F， Quan W， Yuan M， Li Y， Zou H， Xia H， Zha L， Fan J， Yu J， Xie W， Yuan J， Chen K， Zhao S， Chu W， Chen Y， Sun P， Meng F， Zhuo T， Zhao Y， Li C， He G， Zhao Y， Wang C， Kavikishor P B， Pan R L， Paterson A H， Wang X， Ming R， Varshney R K. The genome of cultivated peanut provides insight into legume karyotypes， polyploid evolution and crop domestication. Nature Genetics， 2019， 51（5）： 865-876 [百度学术]

Chen X， Lu Q， Liu H， Zhang J， Hong Y， Lan H， Li H， Wang J， Liu H， Li S， Pandey M K， Zhang Z， Zhou G， Yu J， Zhang G， Yuan J， Li X， Wen S， Meng F， Yu S， Wang X， Siddique K H M， Liu Z J， Paterson A H， Varshney R K， Liang X. Sequencing of cultivated peanut， Arachis hypogaea， yields insights into genome evolution and oil improvement. Molecular Plant， 2019， 12（7）： 920-934 [百度学术]

Newman C S， Andres R J， Youngblood R C， Campbell J D， Simpson S A， Cannon S B， Scheffler B E， Oakley A T， Hulse-Kemp A M， Dunne J C. Initiation of genomics-assisted breeding in Virginia-type peanuts through the generation of a de novo reference genome and informative markers. Frontiers in Plant Sciences， 2023， 13： 1073542 [百度学术]

Huang L， Ren X， Wu B， Li X， Chen W， Zhou X， Chen Y， Pandey M K， Jiao Y， Luo H， Lei Y， Varshney R K， Liao B， Jiang H. Development and deployment of a high-density linkage map identified quantitative trait loci for plant height in peanut （Arachis hypogaea L.）. Scientific Reports， 2016， 6： 39478 [百度学术]

姜慧芳，任小平，张晓杰，黄家权，雷永，晏立英，廖伯寿， Hari D Upadhyaya， Corley C Holbrook. 中国花生小核心种质与ICRISAT微核心种质的SSR遗传多样性比较. 作物学报， 2010， 36 （7）： 1084-1091 [百度学术]

Jiang H F， Ren X P， Zhang X J， Huang J Q， Lei Y， Yan L Y， Liao B S， Upadhyaya H D， Holbrook C C. Comparison of genetic diversity between peanut mini core collections from China and ICRISAT by SSR markers. Acta Agronomica Sinica， 2010， 36 （7）： 1084-1091 [百度学术]

Luo H， Pandey M K， Khan A W， Guo J， Wu B， Cai Y， Huang L， Zhou X， Chen Y， Chen W， Liu N， Lei Y， Liao B， Varshney R K， Jiang H. Discovery of genomic regions and candidate genes controlling shelling percentage using QTL-seq approach in cultivated peanut （Arachis hypogaea L.）. Plant Biotechnology Journal， 2019， 17（7）： 1248-1260 [百度学术]

Varshney R K， Pandey M K， Janila P， Nigam S N， Sudini H， Gowda M V， Sriswathi M， Radhakrishnan T， Manohar S S， Nagesh P. Marker-assisted introgression of a QTL region to improve rust resistance in three elite and popular varieties of peanut （Arachis hypogaea L.）. Theoretical and Applied Genetics， 2014， 27（8）： 1771-1781 [百度学术]

王娟，刘宇，李春娟，闫彩霞，赵小波，单世华. 基于简化基因组的花生InDel标记开发和功能解析.植物遗传资源学报， 2019， 20（1）： 179-187 [百度学术]

Wang J， Liu Y， Li C J， Yan C X， Zhao X B， Shan S H. Development and functional analysis of peanut insertion and deletion （InDel） markers based on genotyping-by-sequencing （GBS）. Journal of Plant Genetic Resources， 2019， 20（1）：179-187 [百度学术]

刘宇，李春娟，石大川，闫彩霞，赵小波，孔青，孙全喜，苑翠玲，王娟，单世华. 利用InDel标记解析中国花生地方品种的遗传多样性与群体结构. 中国油料作物学报， 2020， 42（5）： 743-752 [百度学术]

Liu Y， Li C J， Shi D C， Yan C X， Zhao X B， Kong Q， Sun Q X， Yuan C L， Wang J， Shan S H. Population genetic diversity and structure of Chinese peanut landraces analyzed by InDel markers. Chinese Journal of Oil Crop Sciences， 2020， 42（5）： 743-752 [百度学术]

陶顺玉，吴贝，刘念，罗怀勇，黄莉，周小静，陈伟刚，郭建斌，喻博伦，雷永，廖伯寿，姜慧芳. 花生InDel标记开发及其在含油量QTL定位中的应用. 作物学报， 2023， 49（5）： 1222-1230 [百度学术]

Tao S Y， Wu B， Liu N， Luo H Y， Huang L， Zhou X J， Chen W G， Guo J B， Yu B L， Lei Y， Liao B S， Jiang H F. Development and employment of InDel marker in peanut QTL mapping of oil content. Acta Agronomica Sinica， 2023， 49（5）： 1222-1230 [百度学术]

黄莉，陈伟刚，李威涛，喻博伦，郭建斌，周小静，罗怀勇，刘念，雷永，廖伯寿，姜慧芳. 花生根部结瘤性状QTL定位. 作物学报， 2023， 49（8）： 2097-2104 [百度学术]

Huang L， Chen W G， Li W T， Yu B L， Guo J B， Zhou X J， Luo H Y， Liu N， Lei Y， Liao B S， Jiang H F. Identification of major QTLs for nodule formation in peanut. Acta Agronomica Sinica， 2023， 49（8）： 2097-2104 [百度学术]

Chen S， Zhou Y， Chen Y， Gu J. Fastp： An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics， 2018， 34（17）： i884-i890 [百度学术]

Deng P， Wang M， Feng K， Cui L， Tong W， Song W， Nie X. Genome-wide characterization of microsatellites in Triticeae species： Abundance， distribution and evolution. Scientific Reports， 2016， 6： 32224 [百度学术]

Chen C， Wu Y， Li J， Wang X， Zeng Z， Xu J， Liu Y， Feng J， Chen H， He Y， Xia R. TBtools-II： A "one for all， all for one" bioinformatics platform for biological big-data mining. Molecular Plant， 2023，16（11）： 1733-1742 [百度学术]

Luo H， Xu Z， Li Z， Li X， Lv J， Ren X， Huang L， Zhou X， Chen Y， Yu J， Chen W， Lei Y， Liao B， Jiang H. Development of SSR markers and identification of major quantitative trait loci controlling shelling percentage in cultivated peanut （Arachis hypogaea L.）. Theoretical and Applied Genetics， 2017， 130（8）： 1635-1648 [百度学术]

Lu Q， Hong Y， Li S， Liu H， Li H， Zhang J， Lan H， Liu H， Li X， Wen S， Zhou G， Varshney R K， Jiang H， Chen X， Liang X. Genome-wide identification of microsatellite markers from cultivated peanut （Arachis hypogaea L.）. BMC Genomics， 2019， 20（1）： 799 [百度学术]

徐志军，赵胜，徐磊，胡小文，安东升，刘洋. 基于RNA-seq数据的栽培种花生SSR位点鉴定和标记开发. 中国农业科学， 2020， 53（4）： 695-706 [百度学术]

Xu Z J， Zhao S， Xu L， Hu X W， An D S， Liu Y. Discovery of microsatellite markers from RNA-seq data in cultivated peanut （Arachis hypogaea）. Scientia Agricultura Sinica， 2020， 53（4）： 695-706 [百度学术]

王玉龙，黄冰艳，王思雨，杜培，齐飞艳，房元瑾，孙子淇，郑峥，董文召，张新友. 四倍体野生种花生A.monticola全基因组SSR的开发与特征分析. 中国农业科学， 2019， 52（15）： 2567-2580 [百度学术]

Wang Y L， Huang B Y， Wang S Y， Du P， Qi F Y， Fang Y J， Sun Z Q， Zheng Z， Dong W Z， Zhang X Y. Development and characterization of whole genome SSR in tetraploid wild peanut （Arachis monticola）. Scientia Agricultura Sinica， 2019， 52（15）： 2567-2580 [百度学术]

Zhang K， Yuan M， Xia H， He L， Ma J， Wang M， Zhao H， Hou L， Zhao S， Li P， Tian R， Pan J， Li G， Thudi M， Ma C， Wang X， Zhao C. BSA‑seq and genetic mapping reveals AhRt2 as a candidate gene responsible for red testa of peanut. Theoretical and Applied Genetics， 2022， 135（5）： 1529-1540 [百度学术]

Pan J， Zhou X， Ahmad N， Zhang K， Tang R， Zhao H， Jiang J， Tian M， Li C， Li A， Zhang X， He L， Ma J， Li X， Tian R， Ma C， Pandey M K， Varshney R K， Wang X， Zhao C. BSA‑seq and genetic mapping identified candidate genes for branching habit in peanut. Theoretical and Applied Genetics， 2022， 135（12）： 4457-4468 [百度学术]

白冬梅，薛云云，张鑫，王鹏冬，黄莉，田跃霞，姜慧芳. 基于SSR标记分析山西地方花生种质遗传多样性. 中国油料作物学报， 2020， 42（5）： 753-759 [百度学术]

Bai D M， Xue Y Y， Zhang X， Wang P D， Huang L， Tian Y X， Jiang H F. Genetic diversity of peanut local germplasm resources in Shanxi province based on SSR markers. Chinese Journal of Oil Crop Sciences， 2020， 42（5）： 753-759 [百度学术]

刘宇，闫彩霞，李春娟，徐洪明，孔青，孙全喜，王娟，单世华. 花生栽培种InDel有效标记筛选与评估. 核农学报， 2020， 34（2）： 256-264 [百度学术]

Liu Y， Yan C X， Li C J， Xu H M， Kong Q， Sun Q X， Wang J， Shan S H. Screening and application of InDel markers in cultivated peanut （Arachis hypogaea L.）. Journal of Nuclear Agricultural Sciences， 2020， 34（2）： 256-264 [百度学术]

请使用 Firefox、Chrome、IE10、IE11、360极速模式、搜狗极速模式、QQ极速模式等浏览器，其他浏览器不建议使用!