苦荞耐盐基因<bold>FtGST2</bold>的克隆及功能初步分析

肖雅文; 王祥儒; 黄旭; 石亚亮; 张凯旋; 何毓琦; 韩渊怀; 周美亮; XIAO Yawen; WANG Xiangru; HUANG Xu; SHI Yaliang; ZHANG Kaixuan; HE Yuqi; HAN Yuanhuai; ZHOU Meiliang

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苦荞耐盐基因FtGST2的克隆及功能初步分析 PDF

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肖雅文 ^1,2
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王祥儒 ^1,2
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韩渊怀 ^1,3
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周美亮 ²
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1. 山西农业大学农学院，晋中030801； 2. 中国农业科学院作物科学研究所/农业农村部粮食作物基因资源评价利用重点实验室，北京 100081； 3. 杂粮种质创新与分子育种山西省重点实验室，晋中030801

最近更新：2024-11-07

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240219003

摘要

课题组前期通过全基因组关联分析获得1个苦荞耐盐相关基因FtGST2（FtPinG0707941400.01）。通过同源比对和保守序列分析发现，该基因属于谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferases）中的四氯代氢醌脱卤素酶亚族（TCHQD）。从中苦3号中克隆出FtGST2基因，对该基因上游2000 bp的启动子序列进行分析发现，34个元件中含有2个脱落酸响应元件与6个茉莉酸甲酯响应元件，而脱落酸与茉莉酸正是植物调控盐胁迫途径的重要激素。为进一步验证FtGST2的功能，对FtGST2在苦荞不同器官中的表达量和不同浓度NaCl处理下的表达量差异进行检测。结果显示，FtGST2在根中的表达量最高，并且FtGST2在100 mmol/L NaCl处理下的表达量最高。同时构建了FtGST2的过表达拟南芥与过表达毛状根，并检测过表达植株的种子发芽率、主根长、鲜重及其生理指标。结果显示，盐处理下FtGST2的过表达拟南芥发芽率和根长均高于野生型，盐处理下FtGST2的过表达毛状根鲜重显著高于对照组A4毛状根。此外，对毛状根的超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶及丙二醛 4个生理指标进行检测后发现过表达FtGST2基因的确能有效提高苦荞毛状根过表达株系的耐盐性。以上试验对FtGST2基因的抗盐功能进行了初步验证，为后续苦荞耐盐品种的选育奠定了一定基础。

关键词

荞麦; 谷胱甘肽-S-转移酶; 盐胁迫

苦荞（Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn.）是蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum Mill）的一年生双子叶植物^［

1］，主要种植于我国云南、贵州、四川等西南山地地区，富含矿物质、膳食纤维、芦丁、荞麦糖醇等营养物质与活性成分。芦丁等黄酮类物质能有效降低血糖、血脂及改善血管收缩，有益于人体心脑血管健康，丰富的膳食纤维可以促进肠胃消化、增强免疫力^{［参考文献 2

百度学术}2］。得益于这些功效，荞麦茶、荞麦面、荞麦酒等产品日益受到消费者的喜爱。

盐胁迫是自然界中的一种非生物胁迫。盐胁迫会导致植物代谢紊乱，会破坏植物的氧化还原系统，植物在代谢过程中所产生的活性氧等物质在体内积累会使植物的生长受到抑制^［

3］。据统计，世界上已有超过8亿公顷的土地（约占世界陆地总面积的6%）是盐碱地^{［参考文献 4

百度学术}4］，并且盐碱地面积还在持续扩大。盐胁迫会使苦荞产生渗透胁迫、离子毒害及氧化损伤^{［参考文献 5

百度学术}5］。渗透胁迫会使气孔关闭，抑制苦荞的光合作用，并且细胞中钠离子、氯离子的积累会抑制酶的活性，影响氮、磷、钾等矿质元素的吸收和运输^{［参考文献 6

百度学术}6］。盐胁迫导致的活性氧物质的产生会破坏苦荞中的脂质、蛋白质及核酸的正常代谢，导致苦荞内部的氧化还原失衡^{［参考文献 7

百度学术}7］。而依赖氧化还原过程的功能受到干扰会使苦荞的生长受到抑制从而导致产量降低^{［参考文献 8

百度学术}8］。由此可见，提高苦荞的耐盐能力是苦荞育种的主要方向之一。

谷胱甘肽转移酶基因（GST，glutathione-S-transferases）家族广泛存在于动物、植物、微生物等多种生物组织中。当生物体遇到高盐、干旱、除草剂、有机污染物等逆境胁迫时，GST能催化谷胱甘肽与羟基自由基、膜脂的氧化产物和其他代谢产物结合，从而减少有害物质对植物的伤害。在拟南芥中过量表达GST基因能降低盐胁迫造成的氧化损伤对拟南芥的影响^［

9］。Zhang等^{［参考文献 10

百度学术}10］发现在苜蓿中GST基因的过表达能增强植物对重金属汞的耐受性。因此，为探究GST基因在苦荞中的耐盐机制，基于课题组前期的全基因组关联分析结果，从中苦3号中克隆出1个GST家族基因FtGST2 ^{［参考文献 11

百度学术}11］，对其进行生物信息学预测与功能分析，初步探讨了FtGST2的生物学功能和耐盐机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究选择克隆FtGST2基因的苦荞品种为中苦3号，该品种由川荞1号诱变而来，具有适应范围广、产量高及抗逆性强的特点。选取饱满的中苦3号种子浸泡于水中30 min，剥掉外壳，在超净工作台内用1%次氯酸钠溶液浸泡15 min，无菌水洗7~8次，将种子风干水分，置于MS培养瓶中，于光周期16 h/8 h，温度25 ℃，湿度75%的组培间内培养。

本研究所使用的大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌菌株GV3101和A4、植物过表达载体pCAMBIA1302（以下简称：1302）均由荞麦基因资源创新研究课题组提供。

1.2 试验方法

1.2.1 苦荞FtGST2的基因克隆

通过前期的全基因组关联分析获得1个耐盐基因FtGST2（苦荞数据登录号：FtPinG0707941400.01）。利用CE Design软件根据FtGST2基因CDS序列与过表达载体pCAMBIA1302图谱设计特异性引物（表1），选取15 d龄生长状态良好的中苦3号幼苗，使用RNA Easy Fast植物组织RNA快速提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取苦荞RNA，得到RNA后使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）将其反转录成cDNA。以中苦3号cDNA为模板使用诺唯赞2×Phanta Max Master Mix高保真酶进行PCR扩增（PCR体系和程序见说明书）， PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收纯化。使用限制性内切酶Nco Ⅰ和Bcu Ⅰ对载体pCAMBIA1302的质粒进行酶切，并把产物纯化回收，将二者纯化产物重组连接并转化至大肠杆菌感受态DH5α中，挑取单克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果比对正确后，即获得过表达载体1302-FtGST2质粒。

表1 本研究所用引物序列

Table 1 Primer sequence used in this study

引物名称 Primer name	引物序列（5'-3'） Primer sequence （5'-3'）	用途 Function
FtGST2-qPCR-F	GCGGATGTTGTGCTGAT	qRT-PCR
FtGST2-qPCR-R	CCTTCTTACTACTTGGCCTCT	qRT-PCR
FtH3-qPCR-F	GAAATTCGCAAGTACCAGAAGAG	内参基因
FtH3-qPCR-R	CCAACAAGGTATGCCTCAGC	内参基因
1302-FtGST2-F	ACGGGGGACTCTTGACCATGGTAATGCAACTTTATCATCATCCAATATCA	过表达载体
1302-FtGST2-R	AAGTTCTTCTCCTTTACTAGTTCAGTATCGCCTAAGCAAACTCC	过表达载体
1302-F	CAGGAAACAGCTATGAC	通用引物
1302-R	TGTAAAACGACGGCCAGT	通用引物

1.2.2 苦荞FtGST2的生物信息学分析

在UniProt Knowledgebase网站（https：//www.uniprot.org/）上搜索GST家族，通过同源比对筛选出苦荞、水稻和拟南芥的GST家族基因ID，使用Tbtools软件制作出进化树文件，利用iTOL网站（https：//itol.embl.de/）进行进化树美化。

将FtGST2蛋白序列上传至Expasy（http：//web.expasy.org/protparam）分析其亲水性；使用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）分析蛋白质的跨膜区；用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）预测信号肽；使用PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）分析蛋白二级结构。

使用TBtools软件提取苦荞基因FtGST2的上游2000 bp序列，将其上传至Plant Care网站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）对启动子的顺式元件进行预测。对预测结果进行筛选，剔除常见的如TATA-box、GC-box、CAAT-box与未知的顺式元件后使用TBtools进行可视化分析。

1.2.3 过表达拟南芥的构建

将获得的过表达载体1302-FtGST2质粒转入农杆菌感受态 GV3101中，挑取单克隆并用1302载体通用引物进行菌液鉴定，鉴定为阳性的菌液加入含卡那霉素（100 mg/mL）与利福平（50 mg/mL）抗生素抗性的YEB液体培养基扩摇至吸光度OD600为0.6~0.8，对菌液离心集菌用浓度为5%的蔗糖水重悬，使用蘸花法对野生型拟南芥进行侵染，避光1 d后于温室正常培养至收种即获得过表达拟南芥1302-FtGST2的T0代种子。用带潮霉素（600 μL/L）抗性的1/2MS培养基对T0代种子进行筛选，对长出的拟南芥幼苗采用CTAB法提取DNA，使用1302-F与1302-FtGST2-R引物和诺唯赞2 × Rapid Taq Master Mix酶进行PCR扩增（表1），通过琼脂糖凝胶电泳检测后获得过表达拟南芥植株（AtOE1、AtOE2、AtOE3）。

1.2.4 过表达毛状根的构建

将获得的过表达载体1302-FtGST2质粒转入农杆菌感受态 A4中，将鉴定为阳性的单克隆菌液与农杆菌A4菌液进行扩摇，当菌液吸光度OD₆₀₀达到0.6~0.8时离心集菌用MS液体进行重悬。采用15 d龄生长状态良好的中苦3号无菌幼苗进行侵染。无菌苗在超净工作台内剪成约2 cm的小段，放入用MS培养液重悬好的菌液中摇晃15 min，置于灭菌后的滤纸上晾干后，将外植体转移至铺两层灭菌滤纸的MS培养基上，2 d后转移至加入头孢霉素（100 mg/mL）的MS培养基上。待外植体长出毛状根后使用1302-F与1302-FtGST2-R引物和诺唯赞2 × Rapid Taq Master Mix酶进行PCR鉴定，即可获得单株阳性过表达毛状根，由农杆菌A4菌液侵染出的为对照组A4毛状根。

1.2.5 FtGST2表达分析

选择 FtH3作为qRT-PCR的内参基因，使用软件Primer5根据FtGST2的CDS序列设计qRT-PCR引物FtGST2-qPCR-F/R（表1）。使用ABI 7500实时荧光定量PCR仪与南京诺维赞Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒进行qRT-PCR检测与分析，体系与程序见说明书。

FtGST2基因在苦荞不同组织的特异性表达分析：取MS培养瓶中15 d龄中苦3号幼苗的根、茎、叶，分别提取RNA，反转录为cDNA，以叶为参照进行表达量分析。

FtGST2基因在不同浓度NaCl处理下的表达分析：将中苦3号种子水培至生根后分别移到0 、50 、100 mmol/L NaCl液体中培养大约12 d，对采用不同处理的苦荞苗分别进行取样，提取RNA，反转录为cDNA，进行qRT-PCR检测。

NaCl处理下不同时间的毛状根表达差异性分析：取毛状根过表达株系（FtOE1、FtOE2、FtOE3）与空白对照毛状根大约2 cm，放入MS液体培养基与含100 mmol/L NaCl的MS液体培养基中（3个重复），黑暗环境下于120 r/min摇床上培养，分别在0、3 、6、12 h 取样，提取RNA，反转录cDNA，进行qRT-PCR检测。

1.2.6 盐处理下拟南芥过表达株系的发芽率统计和主根长测量

T2代FtGST2拟南芥过表达株系（AtOE1、AtOE2、AtOE3）与野生型拟南芥（WT，wide type）种子先以75%的乙醇消毒10 min后再用无水乙醇消毒10 min，在超净工作台吹干。消毒处理后的拟南芥种子分别均匀点播在含0 mmol/L NaCl 的1/2MS培养基（下文简称未处理）和含100 mmol/L NaCl的1/2MS培养基上，春化（4℃）2 d，转移至组培间培养7 d后统计发芽率。培养至根长1 cm左右后，将其转移至含100 mmol/L NaCl的1/2MS培养基上，生长7 d后测量根长（3次生物学重复）。

1.2.7 盐处理下毛状根过表达株系的鲜重及生理指标测定

取毛状根过表达株系与长势一致的农杆菌感受态A4侵染的毛状根放入含0 mmol/L NaCl 的液体MS培养基中（下文简称未处理）和含100 mmol/L NaCl的MS培养基中，在黑暗环境下于120 r/min摇床上培养20 d。称量毛状根鲜重，然后用液氮速冻，研磨成粉末，称取0.1 g，用索莱宝生理指标试剂盒检测超氧化物歧化酶（SOD， superoxide dismutase）、过氧化物酶（POD， peroxidase）、过氧化氢酶（CAT， catalase）及丙二醛（MDA， malondialdehyde）含量。

2 结果与分析

2.1 苦荞耐盐基因FtGST2的克隆

以中苦3号幼苗cDNA为模板，用特异性引物1302-FtGST2-F/R进行扩增，使用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测（图1）。该目的基因条带大小在750~1000 bp之间，与FtGST2大小一致，FtGST2编码区全长804 bp ，编码268个氨基酸。

图1 苦荞基因FtGST2的克隆

Fig.1 Cloning of tartary buckwheat gene FtGST2

M：DL 2000 marker；1：FtGST2基因的PCR扩增条带

1： PCR amplification bands of the FtGST2 gene

2.2 FtGST2的基因家族进化树

为了解FtGST2类型与结构，在苦荞、拟南芥和水稻的基因组中对其同源基因进行筛选与分析（图2）。发现在苦荞中GST基因家族有69个成员，在拟南芥中有68个，水稻中有17个。对GST基因家族进行聚类，分为8个亚家族，其中FtGST2属于四氯代氢醌脱卤素酶亚家族。

图2 苦荞、拟南芥、水稻GST基因家族系统进化树

Fig.2 Phylogenetic tree of tartary buckwheat， Arabidopsis and rice GST gene family

苦荞、拟南芥及水稻的GST基因家族进化树分为8个亚家族；四氯代氢醌脱卤素酶（TCHQD）亚族中用白色字体标注的苦荞基因ID为FtGST2

The GST gene family of tartary buckwheat， Arabidopsis thaliana and rice were divided into 8 subfamilies；The buckwheat gene ID labelled in white in the TCHQD subfamily is FtGST2

2.3 蛋白生物信息学分析

对FtGST2的跨膜结构域预测结果显示该基因编码蛋白不含跨膜结构域（图3A），信号肽分析结果显示蛋白无信号肽（图3B）。对其进行亲疏水性分析发现，在整条多肽链的氨基酸标度值中，负值占比大于正值，推测该蛋白为亲水性蛋白（图3C）。二级结构中延伸链占比4.49%，螺旋链占比约为56.17%，卷曲链约占39.34%（图3D）。

（图3）

A：跨膜结构域分析；B：信号肽分析；C：蛋白亲疏水性分析；D：蛋白二级结构；蓝色为延伸链，红色为螺旋链，黑色为卷曲链

A： Transmembrane domain analysis； B： Signal peptide analysis； C： Protein hydrophilicity analysis；D： Protein secondary structure； blue for extended chains， red for spiral chains， black for curly chains

图3 FtGST2蛋白结构分析

Fig.3 FtGST2 protein structure analysis

提取FtGST2编码区上游2000 bp的序列分析启动子区顺式作用元件的数量和类型（图4、表2）。FtGST2的启动子区含有34个元件，其中光响应元件17个，植物激素响应元件9个（生长素响应元件1个、脱落酸响应元件2个、茉莉酸甲酯响应元件6个），参与防御和胁迫的顺式作用元件1个，厌氧响应元件3个，玉米醇溶蛋白代谢元件1个，植物分生组织调控元件2个和MYBHv1结合位点1个。从上述结果来看，在FtGST2基因的植物激素响应元件中茉莉酸甲酯响应元件是最多的。脱落酸、茉莉酸在植物响应盐胁迫调节机制中发挥着重要作用，由此推测FtGST2基因可能参与苦荞的耐盐机制。

图4 FtGST2启动子结构

Fig.4 The structure of FtGST2 promoter

表 2 FtGST2基因启动子顺式作用元件

Table 2 Cis-elements in FtGST2 gene promoter

位点名称 Site name	位点功能 Function of site	元件数量 Quantity of element	概况 Overview
GT1-motif	Light responsive element	3	光响应
G-box	cis-acting regulatory element involved in light responsiveness	1
GA-motif	Part of a light responsive element	1
TCT-motif	Part of a light responsive element	2
MRE	MYB binding site involved in light responsiveness	1
Sp1	Light responsive element	1
Box 4	Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness	6
GATA-motif	Part of a light responsive element	1
TCCC-motif	Part of a light responsive element	1
TGA-element	Auxin-responsive element	1	植物激素
CGTCA-motif	cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness	3
ABRE	cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness	2
TGACG-motif	cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness	3
TC-rich repeats	cis-acting element involved in defense and stress responsiveness	1	防御和胁迫响应
ARE	cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction	3	厌氧响应
O2-site	cis-acting regulatory element involved in zein metabolism regulation	1	蛋白代谢调节
CAT-box	cis-acting regulatory element related to meristem expression	2	分生组织表达
CCAAT-box	MYBHv1 binding site	1	转录因子结合位点

2.4 FtGST2基因的表达特性分析

FtGST2基因在不同的组织中表达量有显著差异，表现出明显的组织特异性。FtGST2在叶中的表达量最低，在根中的表达量最高，为叶中的10.68倍，而茎中的表达量为叶中的3.32倍（图5A）。在不同浓度NaCl的处理下，随着盐浓度的增加FtGST2的表达量逐渐增高，在50 mmol/L NaCl处理下，FtGST2的表达量是未处理的4.36倍，在100 mmol/L NaCl处理下，FtGST2的表达量是未处理时表达量的11.63倍（图5B）。对过表达毛状根与A4毛状根在100 mmol/L NaCl处理下不同时间段的表达量结果分析发现，FtGST2基因在受到盐胁迫3 h后表达量急速上升，接着在6 h处回落，后随着时间增加至12 h而又有所上升（图5C）。以上结果表明，FtGST2基因在苦荞的根中表达量最高，且其表达量受盐胁迫的诱导。

图5 FtGST2基因的差异性表达

Fig.5 Differential expression of FtGST2 gene

A：FtGST2基因在苦荞不同组织中的表达；B： FtGST2基因在不同浓度Nacl处理下的表达差异；C：FtGST2过表达毛状根与A4毛状根在100 mmol/L NaCl盐处理下不同时间段的表达情况；*、**、****分别表示在P<0.05、0.01、0.0001水平上差异显著；下同

A： Expression of FtGST2 gene in different tissues of tartary buckwheat； B： Differences in FtGST2 expression under different concentrations of NaCl； C： Expression of FtGST2 overexpressed hairy roots and A4 hairy roots at different time periods under 100 mmol/L NaCl salt treatment；*， **， **** represent significant difference at P<0.05，0.01，0.0001 level，respectively；The same as below

2.5 FtGST2过表达拟南芥构建及表型分析

为了分析FtGST2基因在植物体内的功能，在拟南芥中过表达了FtGST2基因，通过PCR鉴定后选出3个过表达FtGST2基因的拟南芥株系AtOE1、AtOE2、AtOE3（图6A）。从过表达拟南芥与野生型拟南芥（WT）在NaCl处理下的萌发情况可以看出，在未处理条件下，WT与过表达拟南芥的种子发芽率差异不明显，在100 mmol/L NaCl处理条件下，过表达拟南芥3个株系的种子发芽情况皆比WT的种子发芽率高（图6B），其中WT的发芽率为70.83%，过表达拟南芥AtOE1、AtOE2、AtOE3的发芽率分别为97.61%、95.23%和100%。为了研究在盐胁迫下的拟南芥根长变化，将WT和过表达拟南芥幼苗分别转移到1/2 MS固体培养基和含100 mmol/L NaCl的1/2 MS固体培养基上垂直培养，测量不同浓度NaCl处理下拟南芥的根长。从根长表型图（图6C）和根长统计柱形图（图6D）可以看出，在未处理条件下，WT和过表达FtGST2植株的主根长都在10 cm左右，无显著差异，而在100 mmol/L NaCl处理下过表达植株的主根明显比WT的主根长，AtOE1、AtOE2、AtOE3的主根长分别为WT的1.80倍、1.92倍与2.10倍，差异极显著。表明在拟南芥中过表达FtGST2基因能明显减轻盐胁迫对根生长的影响。

图6 过表达拟南芥的构建与盐胁迫下的表型分析

Fig.6 Construction of overexpression in Arabidopsis thaliana and phenotypic analysis under salt stress

A：过表达拟南芥阳性鉴定；M：DL5000 marker；1~3：3个FtGST2过表达株系；B：过表达拟南芥与WT的发芽情况；C：过表达拟南芥与WT的根长变化；D：过表达拟南芥与WT的根长统计柱形图

A： Positive identification of overexpression in Arabidopsis thaliana； 1~3： Three FtGST2 overexpression strains； B： Germination of overexpressed Arabidopsis thaliana and WT； C： Changes in root length of overexpressed Arabidopsis thaliana and WT； D： Statistical histogram of root length overexpressed Arabidopsis thaliana and WT

2.6 FtGST2过表达毛状根构建及表型分析

为了进一步探究FtGST2基因在苦荞中的功能，在苦荞毛状根中过表达了FtGST2基因，鉴定出3个FtGST2过表达毛状根株系（FtOE1、FtOE2、FtOE3）（图7A）。以农杆菌A4浸染的毛状根作为空白对照，分别用MS液体培养基和100 mmol/L NaCl +MS液体培养基对毛状根进行振荡培养（图7B），培养20 d后称量毛状根的鲜重。结果显示，在未处理环境下，A4毛状根与过表达毛状根的鲜重无明显差异，而在100 mmol/L NaCl处理条件下，FtGST2过表达毛状根3个株系的鲜重都与对照组A4毛状根有显著差异，3个过表达株系比A4毛状根的鲜重分别增加了0.42 g、0.55 g、0.61 g，增加的平均值为空白对照的2.24倍（图7C）。

图7 FtGST2过表达毛状根的构建与表型

Fig.7 Construction and phenotype of hairy roots overexpressed by FtGST2

A：过表达毛状根DNA的PCR鉴定； M：DL 5000 marker；1~3：FtGST2过表达毛状根株系的PCR扩增；B：毛状根培养；a：苦荞无菌苗；b：外植体受农杆菌浸染后长出毛状根；c：从外植体获得的毛状根株系；d：毛状根在液体培养基中振荡培养； C：毛状根在不同盐处理下的鲜重； ns表示在P<0.05水平上差异不显著

A： PCR identification of overexpressed hairy root DNA； 1-3： PCR amplification of hairy roots with FtGST2 overexpression； B： Hairy root culture； a： Tartary buckwheat sterile seedlings； b： Exoplands are infected with Agrobacterium and grow hairy roots； c： Hairy root lines obtained from exocolonies； d： Hairy roots are incubated in liquid medium with shaking； C： Fresh weight of hairy roots under different salt treatments； ns represents no significant difference at P<0.05 level

SOD、POD、CAT的检测结果显示，在未处理环境下，A4毛状根与过表达毛状根的酶活性基本一致，差异不显著，在100 mmol/L NaCl处理下，对照A4和3个过表达毛状根株系的酶活性均有升高，且过表达毛状根酶活性的升高幅度明显高于A4毛状根（图8），3个过表达毛状根株系的SOD、POD、CAT含量的平均值分别是A4毛状根的1.70倍、1.50倍、1.43倍，差异显著。MDA的检测结果显示，未处理环境下过表达毛状根的MDA含量高于A4毛状根，FtOE1、 FtOE2和 FtOE3的MDA含量分别是A4毛状根的1.72倍、 2.23倍、 1.84倍。在100 mmol/L NaCl处理下A4毛状根与过表达毛状根的MDA含量都有不同程度的增加，A4毛状根在100 mmol/L NaCl处理下MDA含量与未处理环境下的A4毛状根酶含量相比增加了1.31倍，但是FtOE1、FtOE2和FtOE3 3个过表达株系只增加了0.25倍、0.33倍和0.45倍。从结果来看，FtGST2过表达株系的MDA含量上升幅度总体低于A4毛状根的MDA含量上升幅度（图8D），在未处理环境下过表达毛状根的MDA含量高于A4毛状根，推测FtGST2在苦荞中过表达可能会影响植株的DNA损伤修复功能，从而导致过表达毛状根MDA含量高于对照组。植物在胁迫作用下SOD、POD、CAT的酶活性与植株抗逆性呈正相关，MDA含量与植株抗逆性呈负相关，MDA含量增长幅度越低表明植物对盐胁迫的抵抗力越强。从以上结果来看，FtGST2的毛状根比A4毛状根对盐胁迫有更强的抵御能力。

SOD： Superoxide dismutase detection；POD：Peroxidase assay； CAT： Catalase detection；MDA： Malondialdehyde detection

图8 过表达毛状根生理指标检测

Fig.8 Detection of physiological indexes of overexpression hairy roots

3 讨论

本研究从中苦3号中克隆出了一个在根中高表达的谷胱甘肽-S-转移酶基因FtGST2，该基因编码区全长804 bp，编码268个氨基酸。FtGST2蛋白不含跨膜结构域，无信号肽，为亲水性蛋白，其二级结构中延伸链占比4.49%，螺旋链占比约为56.17%，卷曲链约占39.34%。研究表明，谷胱甘肽-S-转移酶作为一种二聚体多功能酶，能够通过偶联各类底物达到解除毒性与缓解非生物胁迫的目的^［

12］，可溶性GST家族可分为Phi、Tau、Lambda、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、Theta、Zeta、四氯代氢醌脱卤素酶（TCHQD）和延伸因子1γ（EF1G）类。其中，Phi、Tau、Lambda、TCHQD和DHAR类是植物特有的^{［参考文献 13

百度学术}13］。本研究中的FtGST2基因属于GST基因家族中的TCHQD亚族，从进化树聚类结果来看，FtGST2与拟南芥中的TCHQD ARATH基因聚类为一支，说明这两个基因的同源性最高。

Sappl等^［

14］对已知的两个拟南芥GST基因中的AtGSTF8和AtGSTU7进行了初步的诱导研究，包括水杨酸、H₂O₂、生物胁迫（细菌与真菌）、非生物胁迫（冷与缺氧）6个胁迫环境^{［参考文献 15

百度学术}15］。观察这两个基因在胁迫环境下不同时间点的GST表达量的变化，对0、1、3 和 12 h 四个胁迫时间点的基因表达量检测结果表明，这两个基因都在盐胁迫3 h处表达量升高，并在12 h处恢复到胁迫前水平。这与本研究FtGST2基因的过表达毛状根受到盐胁迫后在3 h处升高，6 h处下降，然后到12 h处又略有升高的表达情况类似。Roxas等^{［参考文献 16

百度学术}16］在烟草中过表达Tau亚族的GST基因提高了烟草的盐和冷胁迫耐受性。Takesawa 等^{［参考文献 17

百度学术}17］在水稻中过表达OsGSTZ2 基因增强了水稻的耐寒性。柽柳 ThGSTZ1 基因的过表达增加了干旱和盐胁迫的耐受性^{［参考文献 18

百度学术}18］。这些结果均表明GSTs的转基因过表达对植物应对非生物胁迫有促进作用，初步证明过表达FtGST2 基因能够增强苦荞的耐盐性。

茉莉酸是一种重要的防御激素，其表达受到水杨酸的负调控^［

19］，并且已有研究表明谷胱甘肽也与茉莉酸途径相互作用^{［参考文献 20

百度学术}20］，其中编码谷胱甘肽合成酶和谷胱甘肽还原酶的基因都受到茉莉酸诱导^{［参考文献 21

百度学术}21］。脱落酸是一种植物激素，可介导植物非生物胁迫耐受性并调节其生长发育。Aleman等^{［参考文献 22

百度学术}22］通过脱落酸受体PYL6 （RCAR9）与转录因子 MYC2 直接相互作用，发现了脱落酸和茉莉酸信号之间的联系。本研究通过对FtGST2基因的启动子序列分析发现该基因含有9个植物激素类响应元件，包括1个生长素响应元件、2个脱落酸响应元件与6个茉莉酸甲酯响应元件。而茉莉酸甲酯与脱落酸响应元件均为可调控GST基因、介导植物响应非生物胁迫的关键元件，说明FtGST2基因的过表达可增加苦荞的耐盐性。有研究表明主根的伸长对植物耐盐性尤为重要，它决定了植株对土壤水分和养分的吸收，以及在幼苗建立早期维持地上部的发育。Hu等^{［参考文献 23

百度学术}23］通过分析盐胁迫下拟南芥自然种群主根长度的自然变化，发现编码MYB转录因子的NIGT1.4是盐胁迫下维持根系生长的重要成员。Reinhardt等^{［参考文献 24

百度学术}24］在盐胁迫条件下，研究棉花幼苗的主根发育和侧根发育的区别与变化，发现在盐胁迫下棉花主要通过主根发育应对胁迫。在拟南芥中，盐胁迫会导致生长素在根部的重新分布，调节主根的生长发育^{［参考文献 25

百度学术}25］，而在水稻中盐胁迫促进脱落酸的累积来影响水稻细胞增殖和主根扩增^{［参考文献 26

百度学术}26］，这些结果都强调盐胁迫下植物根系发育的重要性。本研究对FtGST2过表达拟南芥受盐胁迫后的表型观察也能发现，在100 mmol/L NaCl处理下过表达株系的根长是野生型根长的1.94倍，有显著性差异。Zhang等^{［参考文献 27

百度学术}27］的实验也证明了盐胁迫对苦荞根的形态有影响。Kiziltepe等^{［参考文献 28

百度学术}28］研究表明GST能与JS-K互作激活 DNA 损伤反应通路诱导细胞凋亡，过表达毛状根在未受盐胁迫的环境下MDA含量增高，可能跟FtGST2基因与调控DNA损伤修复的基因互作有关，后期可通过检测调控DNA损伤修复通路的相关基因表达量变化来验证二者关系。综上所述，本研究初步证明过表达苦荞FtGST2基因能够提高拟南芥的耐盐能力，并可能主要是通过脱落酸或茉莉酸调控主根的生长发育实现的。同时茉莉酸还参与黄酮类化合物合成途径中相关基因的表达。左倩等^{［参考文献 29

百度学术}29］发现FtHSFA6b转录因子能够通过影响毛状根类黄酮合成中的具体途径来调控苦荞的耐盐性。翁文凤等^{［参考文献 30

百度学术}30］研究也表明，FtbZIP5基因是通过提高苦荞毛状根中的黄酮积累来增强其耐盐性的。后续将对FtGST2是否参与毛状根类黄酮合成途径进行研究，并利用FtGST2过表达毛状根对其黄酮类物质含量进行检测，观察类黄酮合成途径中的相关物质含量是否得到提高，来进一步探索FtGST2基因在苦荞中的耐盐机制。

4 结论

本研究从中苦3号中克隆出一个耐盐基因FtGST2。该基因在根中的表达量最高并且受盐胁迫调控。对过表达拟南芥进行根长试验发现，该基因受到盐胁迫后主要是通过在根部高表达来抵抗盐胁迫。对过表达毛状根盐处理后发现，盐处理下过表达毛状根的鲜重远高于A4毛状根的鲜重，并且生理指标的结果也显示，过表达毛状根的POD、CAT、SOD酶活性比A4毛状根显著提高，MDA的酶含量增长幅度远低于A4毛状根，说明过表达FtGST2基因提高了苦荞的耐盐性。

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