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向日葵ARF基因家族鉴定及其在花发育中的功能分析  PDF

  • 邓玉萍 ✉
  • 王倩
  • 张敏慧
  • 王茜
  • 陈静
  • 杨军
  • 邹建 ✉
西华师范大学生命科学学院西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川南充 637002

最近更新：2024-11-07

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240223009

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摘要

生长素响应因子是一类生长素响应转录因子，在花发育调控中发挥重要作用，但其在向日葵花发育中的作用尚未见报道。基于本实验室前期构建的向日葵转录组数据，筛选到39个向日葵ARF基因，分属于5个类群，且同一类群成员具有相似的基因结构、保守结构域和保守基序。组织特异性表达模式分析发现，其中20个ARF基因可能与向日葵花发育调控相关。分析这20个ARF基因在光雾山野生葵（WT）和花分生组织决定与花器官分化缺陷突变体cb1（cb1， crazy broccoli 1）中的表达差异，发现gene33195、gene34899、gene58924、gene2145和gene16681在WT花发育St2至St4时期（花原基起始期、花器官开始形成期和减数分裂期）高水平表达，在花发育后期几乎不表达；它们在cb1中表达水平被上调，且与WT花发育早期峰值水平相当。另一个ARF基因gene70445在cb1突变体的整个花发育时期的表达水平均远高于WT。这些结果说明，这6个ARF基因在花分生组织转变和花器官发生中发挥关键作用。启动子顺式作用元件分析发现，这6个基因的启动子区存在多个AP2/ERF、MIKC_MADS和LFY识别元件，说明它们在向日葵花分生组织转变和花器官发生调控中，可能受到AP2/ERF、MIKC_MADS和LFY家族基因的调节。本研究为深入探究向日葵ARF基因在花发育调控中的功能和分子机制提供重要线索，也为向日葵新品种选育提供参考。

向日葵（Helianthus annuus L.）为菊科（Asteraceae）一年生草本作物，是世界四大油料作物之一［

1］，在我国的农业生产、油料及饲料加工产业中具有重要地位［2］。研究向日葵发育调控机制，筛选挖掘其潜在增产基因是改良向日葵农艺性状，提高其产量的重要途径。

花发育是被子植物生命周期中的重要进程，对于种子产生和物种延续具有重要意义，并与作物的产量密切相关。该过程受诸多内外因素的影响［

3］，其中生长素（IAA，auxin）在植物花发育过程中发挥重要作用，如维持花原基形成和花器官分化中干细胞的活性，调节花器官形态及数量，影响生殖活力等［4-8］。在拟南芥中，生长素合成基因YUC1、YUC2、YUC4和YUC6的功能缺失将导致叶片和花器官生长素组织特异性缺乏，使得花发育受到不同程度的影响［5］。生长素的功能发挥离不开生长素响应因子和转录调控因子的相互作用［9］。在生长素信号转导途径中，生长素与受体TIR1/AFBs结合，并通过对转录抑制子Aux/IAA蛋白的泛素化调节来调控生长素响应因子ARF的活性［10］。在低浓度生长素条件下，Aux/IAAs与ARF二聚化，与共抑制因子TPL协同抑制ARF蛋白的活性［11］，从而抑制下游生长素响应基因的表达。随着生长素水平的升高，生长素与SCFTIR1/AFBs复合体识别并结合［12］，招募特异性靶标Aux/IAAs，再通过泛素化降解Aux/IAAs，以释放并激活ARF蛋白，ARF蛋白通过特异性识别生长素响应元件（AuxREs）TGTCTC［13］，激活或抑制生长素响应相关基因的表达，从而调控植物生长发育过程。拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtARF3基因失活导致其花被数量增加，雄蕊和花药减少［14］。水稻（Oryza sativa）OsARF1沉默导致植株矮小，并伴随着开花显著延迟或不育，甚至出现无花个体［15］，OsARF12、OsARF6、OsARF17和OsARF25任意基因被沉默时，其花器官呈现出雄蕊花丝延长失败，导致柱头明显增大［16］。SlARF14-RNAi转基因番茄（Solanum lycopersicum）植株的花器官呈现出易衰败死亡的特征，其雌蕊柱头和子房异常发育并表现出严重的授粉障碍［17］。因此，ARF基因家族成员在生长素调控植物花发育进程中发挥着重要作用。

然而ARF家族成员在向日葵花发育过程中的生物学功能和分子调控机制暂未见报道。本研究基于生物信息学分析对向日葵ARF家族成员进行筛选鉴定，并通过分析向日葵ARF基因在花发育进程中的组织表达模式，鉴定花发育相关的ARF基因，随后利用向日葵花器官发育缺陷突变体cb1分析鉴定到花分生组织转变和花器官分化调控相关的ARF家族成员，以期为深入探究ARF家族基因在向日葵花发育调控中的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以四川野外繁育的向日葵地方种质资源光雾山野生葵（WT，GW MountainWild）及其航天诱变突变体cb1（cb1，crazy broccoli 1）为试验材料。cb1是基于光雾山野生葵航天向日葵突变体库筛选得到的一个花分生组织决定与花器官分化缺陷突变体。以上两种材料于2023年4月初育苗，4月下旬移栽至西华师范大学生命科学学院试验田（中国四川省南充市，30°49′N， 106°4′E）。WT和cb1突变体的种植数量均大于1000株，行距1 m，株距0.5 m。分别在幼苗生长期和临近花期追肥，实时监控，及时进行病虫害防治，以保证植株的健康生长。

1.2 向日葵ARF转录因子家族成员的鉴定及理化性质分析

本研究基于本实验室构建的向日葵转录组数据库（NCBI登录号为PRJNA1083261），筛选获得ARF基因同源序列，并利用NCBI的CCD数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb. cgi）和SMART在线分析工具 （http：∥smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白的保守结构域，剔除不含ARF基因家族特征结构域的基因，保留至少具有B3、Auxin_resp 这2个保守结构域的基因作为向日葵ARF基因家族成员。

利用Prot Param在线网站（http：∥web.expasy.org/protparam/）分析ARF蛋白的基本理化性质；在Plant-mPLoc网站（http： //www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）预测ARF蛋白的亚细胞定位。

1.3 ARF蛋白的系统发育分析

从TAIR数据库（https： //www.arabidopsis.org/）下载拟南芥ARF蛋白序列，利用在线工具NCBI的CD-search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrps b.cgi）分析拟南芥和向日葵ARF蛋白的保守结构域。通过ClustalW 进行序列比对。利用MEGA7.0软件，采用邻接法 （NJ，neighbor-joining），设置校验参数（bootstrap）为1000，构建系统发育树。

1.4 ARF基因的染色体分布及基因结构分析

从NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库获取向日葵基因组注释文件gff3文件和ARF基因在染色体组中的位置信息，使用TBtools软件进行可视化分析染色体分布。利用gff3文件使用TBtools可视化分析ARF家族的基因结构。

1.5 ARF蛋白的保守结构域及保守基序分析

利用NCBI的CD-search在线工具分析ARF蛋白的保守结构域；利用MEME （https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）在线数据库分析ARF蛋白的保守基序，最后使用TBtools软件进行可视化分析。利用DNAMAN软件进行多序列比对。

1.6 ARF基因的组织表达模式分析

基于本实验室构建的向日葵转录组数据库，提取向日葵在根、茎、叶、幼根、幼茎、幼叶、花和果实不同的St2~St8时期［St2：花原基起始期，St3：花器官开始形成期，St4：减数分裂期，St5：花粉成熟期，St6：小花开放期，St7：果实灌浆期（胚胎发育期），St8：种子饱满期（胚胎发育完成）］的表达数据（TPM， transcripts per million），利用TBtools绘制热图分析39个ARF基因的组织表达模式。

1.7 向日葵WT和cb1突变体的表型分析

取向日葵WT和cb1植株St2至St6共5个花发育时期的花盘，分析其形态差异。用尖嘴镊除去花盘周围的萼片，并用刀片对花盘分别进行横切和纵切，将St2与St3时期的花盘置于体式显微镜下进行拍照观察，而St4、St5和St6时期花盘较大，置于黑色幕布上用相机拍照观察。

1.8 ARF基因在WT和cb1突变体中的表达分析

取向日葵幼根、幼茎、幼叶、根、茎、叶和花发育St2至St6时期的花组织材料，取样植株数量>50，各组织均为混合样品，以避免个体之间的差异所带来的实验误差。使用植物 RNA 提取试剂盒E.Z.N.A®Plant RNA Kit（OMEGA，美国）提取总RNA。利用PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（TaKaRa，中国 ）合成cDNA为模板，参照TB Green® Premix Ex Taq™ II（TaKaRa，中国），在SYBR Green Supermix上的Bio CFX96d定量PCR扩增仪上进行RT-PCR扩增（ Bio-Rad，美国）。程序如下：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火及延伸30s，40个循环。以向日葵HaeF1A基因（HaeF1A，Helianthus annuus Elongation Factor 1 Alpha）作为内参基因，使用2-∆∆Ct法分析各基因的相对表达量，3次生物学重复计算标准误差。ARF基因及内参HaeF1A引物见表1。

表1  向日葵ARF基因表达分析的实时荧光定量引物
Table 1  RT-qPCR primers of ARF genes for expression analysis in sunflower

基因

Gene

正向引物序列（5'-3'）

Forward primer sequences（5'-3'）

反向引物序列（5'-3'）

Reverse primer sequences（5'-3'）

gene64257 TCTGACTACCGGGTGGAGTA AGCGCGTCTAATTCCAACAC
gene68557 GCGCTCGGGTGATCTATTTC GGGCATGTGAGCTTCGATTT
gene68106 AACCTCCGGCCCAAGAATTA CAGCCCGTTGTGAGAAGATG
gene16614 CCTTGGCCGGAGTTTGTAAG CTCAAGCGAACCCACTGATG
gene47563 CAAGTCAACGGTCAACAGCA ACACTTGATTGCGGCTTTGT
gene49293 TCTTTCTGCACTCGGGATGT CCAATGGATACCACCACCCT
gene70445 CGGTTTCTTCGGTTCATGCT GGCTTACTCGCTTCACGTTT
gene9534 ACCTTCAACAACAGCAGCAG GTGGCAACAGGTTGTTCTGT
gene34899 AAAGCCATCGGTGGATGTTG TTGCATGGCTGTTGCTTCTT
gene23770 GAGGATTCCAAGTGGCGTTC TTTCGGTGCAACTGGTTGAG
gene58924 TGAATGCCTACCTCCCTTGG AGCAAATGCCTTCTGGGTTG
gene16681 CATGCTTGTGCTGGACCTTT ACTAAACTCGCCAGAACCCA
gene5350 CTATGCAACATCGCGTGCTA CCACGACCTCATCATAGGCT
gene2145 ACAAATTCTCGCTGGGAACG ACACCATCCCACTTTACCGT
gene33195 GCTAGCCTTGTTGATTCGCA CGATAGACCTCCCAACCGAA
gene64801 TTGACGACCGGTTGGAGTAA CCGACACAAAGATCGCCATT
gene75869 CACAAATAGAGGGCGGTTGG CTCGTACCGCTAACTGGACT
gene56407 AACCTTGACGCAATCTGACG GTTTGAACCGGAGGATCTGC
gene68026 ATAGAGGACAGCCTCGGAGA TTCGGATGCCCAACCTTAGT
gene14118 CCTCGTCCAGAGAGAGTGTC ACCGGAAGCGGATTTATTGC
HaeF1A AGCCCAAGAGACCCTCAGACAAG CCCTGATGGTCCGAAGGTAACAA

1.9 ARF基因启动子顺式作用元件预测

从NCBI下载向日葵ARF基因起始密码子上游区域2000 bp的启动子序列，利用PlantTFDB（http：//planttfdb.gao-lab.org/prediction.php）分析其顺式作用元件，最后利用TBtools和GraphPad Prism 5进行数据可视化。

2 结果与分析

2.1 向日葵ARF转录因子家族成员的鉴定及理化性质分析

基于本实验室前期构建的向日葵转录组数据库和NCBI在线数据库筛选获得39个向日葵ARF候选基因。保守结构域分析结果显示，23个ARF基因编码的蛋白具有B3、Auxin_resp和Aux_IAA保守结构域（表2）；其余16个具有B3和Auxin_resp保守结构域。理化性质分析结果显示，39个ARF蛋白质长度在270 aa~1096 aa之间，分子质量在30.94~122.74 kDa之间，等电点在5.38~9.21之间。在这些蛋白中，除gene68026、gene16681、gene31333、gene2145和gene5350的编码蛋白外，其余34个ARF蛋白为酸性蛋白。此外，亲疏水性预测分析和亚细胞定位预测分析结果显示，39个ARF蛋白均为定位于细胞核基质中的亲水性蛋白。

表2  向日葵ARF家族基因基本信息
Table 2  Basic information of ARF family genes in sunflower

基因

Gene

基因 IDGene ID蛋白长度（aa）Protein length分子量（kDa）Molecular weight等电点PI亚细胞定位Subcellular localization亲水系数GRAVY

保守结构域

Conserved domain

gene31334 LOC110872732 369 41.34 5.91 细胞核 -0.491 B3、Auxin_resp
gene64801 LOC110904658 630 70.24 6.27 细胞核 -0.364 B3、Auxin_resp
gene31333 LOC110872731 407 45.27 8.36 细胞核 -0.408 B3、Auxin_resp
gene30880 LOC110872467 622 70.01 6.39 细胞核 -0.452 B3、Auxin_resp
gene64257 LOC110904291 643 71.15 6.27 细胞核 -0.401 B3、Auxin_resp
gene56407 LOC110900998 636 70.87 5.62 细胞核 -0.257 B3、Auxin_resp
gene70410 LOC110913015 655 72.05 6.79 细胞核 -0.390 B3、Auxin_resp
gene20979 LOC110941009 667 73.85 5.46 细胞核 -0.377 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene70445 LOC110913044 503 56.12 5.97 细胞核 -0.413 B3、Auxin_resp
gene7473 LOC110924766 657 72.45 6.79 细胞核 -0.506 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene33195 LOC110873708 862 95.68 5.38 细胞核 -0.508 B3、Auxin_resp、/Aux_IAA
gene2145 LOC110870922 573 63.97 8.76 细胞核 -0.419 B3、Auxin_resp
gene35115 LOC110877733 539 59.64 6.18 细胞核 -0.446 B3、Auxin_resp
gene27221 LOC110867964 626 70.26 6.38 细胞核 -0.541 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene64296 LOC110904319 757 84.08 6.10 细胞核 -0.470 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene68026 LOC110911772 604 67.38 7.20 细胞核 -0.469 B3、Auxin_resp
gene57466 LOC110898684 759 83.77 6.17 细胞核 -0.472 B3、Auxin_resp
gene23770 LOC110864445 633 70.71 6.14 细胞核 -0.504 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene21961 LOC110941533 808 90.36 6.27 细胞核 -0.600 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene5350 LOC110913846 270 30.94 9.21 细胞核 -0.525 B3、Auxin_resp
gene58924 LOC110899475 647 72.87 5.54 细胞核 -0.452 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene68106 LOC110911810 843 93.28 5.95 细胞核 -0.428 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene16614 LOC110937214 840 92.83 6.16 细胞核 -0.403 B3、Auxin_resp
gene60964 LOC110908143 783 85.83 6.49 细胞核 -0.496 B3、Auxin_resp
gene77736 LOC110921231 809 90.56 6.09 细胞核 -0.595 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene16681 LOC110937249 566 63.13 8.09 细胞核 -0.480 B3、Auxin_resp
gene75869 LOC110925580 654 72.71 6.22 细胞核 -0.641 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene14118 LOC110935887 801 89.10 5.92 细胞核 -0.606 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene4811 LOC110911065 774 86.62 6.21 细胞核 -0.590 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene68557 LOC110912077 805 90.15 5.95 细胞核 -0.466 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene44140 LOC110886230 1014 112.10 5.72 细胞核 -0.481 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene47563 LOC110890145 777 87.34 5.84 细胞核 -0.515 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene49293 LOC110891065 644 72.39 5.71 细胞核 -0.507 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene63042 LOC110909189 851 95.07 5.77 细胞核 -0.526 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene34899 LOC110877618 970 107.52 5.93 细胞核 -0.564 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene75575 LOC110915653 775 86.70 5.98 细胞核 -0.464 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene9534 LOC110929007 968 107.38 6.33 细胞核 -0.534 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene50913 LOC110894082 1096 122.74 6.05 细胞核 -0.657 B3、Auxin_resp、Aux_IAA
gene8442 LOC110928437 1052 118.35 6.53 细胞核 -0.679 B3、Auxin_resp、Aux_IAA

GRAVY：Grand average of hydro pathicity

2.2 ARF蛋白的系统发育分析

为分析39个向日葵ARF蛋白之间的进化关系，本研究构建了拟南芥和向日葵系统发育树（图1）。根据Okushima等［

18］的分类方法，39个向日葵ARF蛋白可分为5个类群。其中类群Ⅰ含有gene47563、gene63042、gene68557、gene75575等13个成员，其中gene20927和gene33195与拟南芥AtARF5高度同源；类群Ⅱ含有gene16681、gene68026、gene2145、gene57466、gene64296和gene60964共6个成员，其中gene2145、gene68026和gene16681与拟南芥AtARF3亲缘关系较近；类群Ⅲ含有gene7473、gene70410、gene56407、gene64257等8个成员，其中gene70410和gene7473与拟南芥AtARF10高度同源；类群Ⅳ含有gene75869、gene58924、gene27221、gene23770、gene49293等9个向日葵ARF家族成员，其中gene49293和拟南芥AtARF1高度同源；类群Ⅴ含有gene31334、gene31333和gene5350共3个成员（图1）。

图1  向日葵和拟南芥ARF蛋白的系统发育分析

Fig.1  Phylogenetic analysis of ARF proteins in sunflower and Arabidopsis thaliana

2.3 ARF基因的染色体分布和基因结构分析

基于向日葵基因组注释信息，对向日葵ARF基因进行了染色体定位，结果见图2A。除1号和11号染色体外，其余15条染色体上均有ARF基因分布。其中，8号、13号、14号和15号染色体均分布有4个ARF基因；2号、4号、6号和7号染色体均分布有3个ARF基因；3号、5号、9号和16号染色体上均分布有2个ARF基因；10号、12号和17号染色体只分布有1个ARF基因。这些结果说明向日葵ARF基因在向日葵染色体组中呈现分散分布。

图2  向日葵ARF基因的染色体定位和基因结构

Fig.2  Chromosomal localization and gene structure of ARF genes in sunflower

A：染色体定位；B：基因结构

A： Chromosomal localization； B：Gene structure

分析ARF基因的外显子/内含子结构（图2B），结果显示，ARF基因家族成员含有4~16个外显子，3~15个内含子。类群Ⅰ含有外显子11~15个，内含子10~14个；类群Ⅱ含有外显子7~13个，内含子6~12个；类群Ⅲ含有外显子4~6个，内含子3~5个；类群Ⅳ含有外显子12~15个，内含子11~15个；类群Ⅴ含有外显子13~14个，内含子12~13个。类群Ⅲ基因较短，类群Ⅴ基因较长，同一类群的ARF基因结构相似，不同类群差异较大。

2.4 ARF蛋白的保守结构域和保守基序分析

保守结构域分析结果表明，23个向日葵ARF蛋白同时具有B3、Auxin_resp和Aux_IAA结构域，包括类群Ⅰ中12个成员，类群Ⅳ中的9个成员，类群Ⅱ和类群Ⅲ各1个成员（图3A）。另外的16个ARF蛋白只含有B3和Auxin_resp结构域，包括类群Ⅴ中的3个成员，类群Ⅱ中5个成员，类群Ⅰ中1个成员和类群Ⅲ中7个成员（图3A）。分析ARF蛋白的保守结构域特征，发现3个结构域中具有多个高度保守的氨基酸位点，如中心功能区Auxin_resp结构域的苯丙氨酸（F，phenylalanine）、甘氨酸（G，glycine）、丝氨酸（S，serine）和色氨酸（W，tryptophan）；与Aux_IAA结构域相比，B3和Auxin_resp的结构域更为保守（图3C）。这些高度保守的结构域，特别是高度保守的氨基酸，可能是ARF蛋白实现功能的关键位点。

图3  向日葵ARF蛋白结构域及保守基序分析

Fig.3  Conserved domains and conserved motifs of ARF proteins in sunflower

A：向日葵ARF基因编码的蛋白保守结构域；B：向日葵ARF基因编码的蛋白保守基序；C：向日葵ARF蛋白结构域序列比对

A： Conserved protein domains encoded by ARF genes in sunflower； B： Conserved protein motifs encoded by ARF genes in sunflower； C： Sequence alignment analysis of ARF proteins in sunflower

进一步分析保守结构域的保守基序发现，Motif1和Motif2属于B3结构域，这两个基序在除gene5350以外，其余ARF蛋白均存在；Motif4、Motif5、Motif9、Motif13和Motif14属于Auxin_resp结构域，其中Motif4、Motif5、Motif9和Motif13分布于全部ARF蛋白，Motif14分布于36个ARF蛋白，在类群Ⅴ的ARF成员中没有分布（图3B）。

2.5 ARF基因的组织特异性表达模式分析

为进一步筛选与花发育相关的向日葵ARF基因，本研究分析了39个ARF基因在野生型向日葵不同组织中的表达情况（图4）。结果显示，不同ARF基因在不同组织器官中表达水平存在明显差异。其中，gene30880在幼根中高表达，gene50913和gene57466在幼茎中高表达，gene21961、gene77736、gene31334和gene8442在根中高表达，其余32个基因中20个基因在花发育时期高水平表达，而另外12个基因未观察到组织表达特异性。此外，20个在花发育时期高水平表达的ARF基因，主要集中在向日葵花发育St2~St4时期高水平表达。其中，gene16681、gene5350、gene2145、gene33195、gene34899和gene49293在St2达到表达峰值，gene23770、gene58924、gene95343、gene70445和gene68026在St2、St3和St4均具有较高的表达水平，gene14118、gene56407、gene64801、gene75809、gene68557、gene64257、gene16614、gene68106和gene47563在St4达到表达峰值。表达峰值在St2的6个ARF基因随着花的发育期表达水平呈现逐渐降低的趋势，但在花发育后期几乎不表达；表达峰值在St4的9个ARF基因，在St2至St4时期其表达水平呈现升高趋势，尤其在St3至St4时期迅速升高，随后快速降低到较低的水平。这些结果说明这20个ARF基因可能在向日葵花发育过程中发挥作用，其中gene16681、gene5350、gene2145、gene33195、gene34899和gene49293可能主要在花发育早期发挥作用。

图4  ARF基因在野生型向日葵不同组织部位的表达分析

Fig.4  Expression analysis of ARF genes in different tissues of wild-type sunflower

St2：Flower primordium initiation stage； St3：Flower organ formation stage； St4：Meiosis stage； St5：Pollen maturation stage； St6：Florets opening stage； St7：Fruit filling stage； St8：Seed full stage；The same as below

2.6 向日葵WT和cb1突变体的表型分析

典型向日葵的头状花序由外轮不育的舌状花和内轮可育的管状花两类小花组成。向日葵花分生组织决定与花器官分化缺陷突变体cb1的花瓣、雄蕊、雌蕊、子房等花器官缺失，花序由重复的苞片和分生组织构成，整体形态与花椰菜相似（图5）。因此cb1向日葵突变体适合用于分析和鉴定花分生组织转变和花器官发生相关的ARF基因。

图5  向日葵野生型和cb1花发育形态对比

Fig.5  Morphology comparison of flower developmental between wild-type and cb1 mutant in sunflower

A：WT向日葵和cb1突变体的花盘；B：WT向日葵和cb1突变体花序纵向剖面图

A： Flower disk of wild-type and cb1 mutant； B： Longitudinal view on inflorescence of wild-type and cb1 mutant

2.7 ARF基因在WT和cb1突变体中的表达分析

为进一步探究ARF基因在向日葵花发育中的功能，分析了以上20个向日葵花发育相关ARF基因在WT和cb1突变体中的表达情况（图6）。结果显示gene33195、gene34899、gene58924、gene2145、gene70445和gene16681的表达水平在WT和cb1中存在较大差异。其中gene33195、gene34899、gene58924和gene16681的表达水平在WT花发育St2至St6时期呈现出持续降低的趋势，但在花发育后期几乎不表达，在cb1突变体中始终维持较高水平的表达，且与野生型峰值期St2时期的表达水平相当。gene2145在WT花发育过程中的表达从St2至St6逐渐降低，但其在cb1突变体各个时期中的表达均被上调，且各时期均高于WT的表达水平。另外，在花发育的5个时期中，gene70445在cb1突变体中的表达被强烈上调，且远高于WT中的表达水平。研究结果还显示，其余14个ARF基因在WT和cb1突变体整体上的表达水平无明显差异。本研究的结果再次说明gene33195、gene34899、gene58924、gene2145、gene70445和gene16681可能与向日葵花发育早期的分生组织转变和花器官发育密切相关。

图6  向日葵ARF基因在WT和cb1突变体中的表达

Fig.6  Expression of ARF genes between WT and cb1 flowers in sunflower

  

2.8 ARF基因启动子顺式作用元件预测

为了探究花分生组织转变和花器官发生相关的向日葵ARF基因的上游调控基因，预测6个向日葵ARF基因的启动子区域内的顺式作用元件（图7）。结果在6个ARF基因上有2000 bp启动子区域共分析到19个转录因子家族基因的识别元件。其中，gene16681、gene2145和gene70445启动子区域具有AP2/ERF、MIKC_MADS和DOf等转录因子家族识别的顺式作用元件，gene34899和gene58924启动子区域存在AP2/ERF和LBD等的识别元件，gene33195启动子区域存在MIKC_MADS和Dof等的识别元件。

图7  向日葵ARF基因的顺式作用元件分析

Fig.7  Cis-acting analysis in the promoters of ARF genes

数字表示顺式作用元件的个数

；

（图6）

Number represents the number of cis-acting elements

根据已有的报道，AP2/ERF、MIKC_MADS和LFY是调节花发育的主要转录因子［

19-24］。梳理后分析发现，具有AP2/ERF转录因子识别元件的基因包括gene16681、gene2145、gene34899、gene58924和gene70445，且在gene34899最多，达35个；能够被MIKC_MADS转录因子识别的基因包括gene16681、gene2145、gene70445和gene33195，其中gene70445有12个元件，gene16681有10个元件；只有gene70445具有2个LFY识别元件（图7）。分析结果说明gene33195、gene34899、gene58924、gene2145、gene70445和gene16681在调控向日葵花发育过程中，其表达活性可能受到AP2/ERF、MIKC_MADS和LFY等转录因子的调节。

3 讨论

花发育作为生殖发育的关键进程之一，受到转录因子和植物激素等诸多因素的影响［

3］。生长素作为重要的植物激素，在植物花发育过程中起着至关重要的作用，而ARF家族成员是生长素信号途径中的关键节点［10］。然而，在向日葵中花发育相关的ARF基因暂未被鉴定，其调控机制暂未见报道。

本研究基于向日葵转录组数据，筛选到39个向日葵ARF转录因子家族成员，分属于类群Ⅰ、类群Ⅱ、类群Ⅲ、类群Ⅳ和类群Ⅴ共5个类群。其中gene16681、gene2145、gene33195、gene34899、gene49293和gene70445等20个ARF基因在花发育前期St2至St4时期高水平表达，说明这些基因可能在向日葵花发育早期发挥调控作用。在向日葵花分生组织决定与花器官分化缺陷突变体cb1的表达情况表明基因gene33195、gene34899、gene58924、gene2145、gene70445和gene16681在cb1突变体中始终维持高水平的表达，并与它们在WT花发育早期的表达水平相当甚至更高。值得注意的是，这6个ARF基因在WT花发育后期几乎不表达，说明它们在cb1突变体中持续高表达可能与花器官分化障碍有关，在向日葵花分生组织转变和花器官发育进程中发挥重要作用。

已有的报道显示，拟南芥ARF家族成员AtARF2功能缺失导致其植株开花延迟，其雌蕊和花萼延长，雄蕊退化［

25-26］。拟南芥AtARF5、AtARF6和AtARF8功能缺失显著降低花粉的育性［27-29］。在向日葵中，同源基因类群Ⅳ成员gene58924以及类群Ⅰ的gene33195和gene34899在WT花器官发生时期高水平表达，随后表达水平逐渐降低，说明它们与拟南芥AtARF2、AtARF5、AtARF6和AtARF8具有相似的功能，也参与调控生殖相关花器官的形成。gene58924、gene33195和gene34899在cb1中持续的异常高表达，可能与cb1分生组织决定异常及生殖器官的缺失密切相关。另外，拟南芥成员AtARF17突变导致花粉破裂形成雄性不育［30］，而其在向日葵中的同源基因gene70445在cb1突变体显著上调，可能与cb1生殖相关的花器官缺失相关。此外，拟南芥成员AtARF3决定花器官原基数量并影响原基的发育，其功能缺失导致萼片和花瓣等花被器官数量增加，雄蕊数量和花药形成减少，雌蕊结构混乱［31］。在WT中，AtARF3的高度同源基因gene2145和gene16681在St2高水平表达，从St2至St6逐渐降低，推测该基因具有调控早期花原基数量和花器官形成的作用。其在cb1突变体各个时期中的表达均被上调，且与WT的St2表达水平相当，推测gene2145和gene16681与cb1花分生组织转变有关。以上的结果说明，gene33195、gene34899、gene58924、gene2145、gene70445和gene16681等6个基因的异常表达会影响花分生组织决定和花器官发育。

在植物花发育过程中，AP2/ERF、MIKC_MADS和LFY是花分生组织的干细胞活性维持和分生组织决定中的关键调控因子［

19-24］。AP2通过识别调控ARF3基因参与花分生组织特性的建立和花器官形成的调控［19-20］。向日葵gene16681、gene2145、gene34899、gene58924和gene70445启动子区包含多个AP2转录因子识别元件，它们在调控向日葵花分生组织决定和花器官发生可能受到AP2的调节。MIKC_MADS家族作为花器官发育调控关键因子，其成员AP1（APETALA 1）、FUL（FRUITFUL）和CAL（CAULIFLOWER）参与花分生组织决定［21］，而SEP1-3（SEPALLATA 1-3）、AP3（APETALA 3）和PI（PISTILLATA）参与调控花器官分化［22］。向日葵gene33195、gene2145、gene70445和gene16681启动子区包含多个MIKC_MADS家族成员识别元件，它们在调控花分生组织转变和花器官分化可能也受到MIKC_MADS家族成员的调节。LFY基因是植物花分生组织形成的关键基因［23-24］，而向日葵gene70445启动子区存在2个LFY识别元件，说明gene70445参与向日葵花分生组织转变和花器官分化可能还与LFY基因的调控相关。

综上所述，向日葵ARF家族成员gene16681、gene2145、gene33195、gene34899、gene49293和gene70445可能在向日葵花分生组织转变和花器官决定过程中发挥着重要作用。在此过程中，这6个基因可能受到AP2/ERF、MIKC_MADS、LFY和家族基因的调控。本研究的研究结果，将为深入探究向日葵ARF基因在花发育调控中的功能和分子机制提供重要线索，也为向日葵新品种选育提供参考。

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