羽衣甘蓝<bold>SSR</bold>指纹图谱构建及不同遗传类群的<bold>SRK</bold>单元型分布

冯一了; 陈文迪; 张斌; 任文静; 韩风庆; 陈立; 方智远; 杨丽梅; 庄木; 吕红豪; 王勇; 季家磊; 张扬勇; FENG Yiliao; CHEN Wendi; ZHANG Bin; REN Wenjing; HAN Fengqing; CHEN Li; FANG Zhiyuan; YANG Limei; ZHUANG Mu; LYU Honghao; WANG Yong; JI Jialei; ZHANG Yangyong

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羽衣甘蓝SSR指纹图谱构建及不同遗传类群的SRK单元型分布 PDF

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冯一了 ^1,2
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陈文迪 ²
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张斌 ²
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1. 青岛农业大学园艺学院，山东青岛 266109； 2. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所/蔬菜生物育种全国重点实验室，北京 100081

最近更新：2024-11-07

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240226002

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摘要

十字花科作物主要由S位点的复等位基因控制自交不亲和性，羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）是十字花科芸薹属中典型的自交不亲和性植物。本研究利用20对SSR引物首次构建了20个羽衣甘蓝自交系的指纹图谱，20对SSR引物共鉴定到65个等位变异，平均每对引物含有3.25个变异。等权重算术平均聚类法（UPGMA）将20个自交系聚类为3个遗传类群：OK1、OK2和OK3。其中遗传类群OK1的叶形为紧凑皱叶或披散皱叶，波浪状叶缘，叶色以红紫色为主；遗传类群OK2的叶形为光滑叶，波浪状或裂叶叶缘，叶色为白色外叶；遗传类群OK3的叶形为光滑叶，波浪状或裂叶叶缘，叶色以红紫色为主。利用SRK基因激酶区的特异性引物分析发现，20个羽衣甘蓝自交系中共有9个SRK单元型，分别是8个Class Ⅰ型SRK单元型（SRK7、SRK13、SRK14、SRK16、SRK23、SRK36、SRK45和SRK51）和1个Class Ⅱ型SRK单元型（SRK15）。遗传类群OK1主要为SRK15单元型（50%），其次为SRK23单元型（20%）；遗传类群OK2主要为SRK15、SRK16单元型（均为40%）；遗传类群OK3主要为SRK23单元型（40%）。亲和指数测定结果进一步验证了不同遗传类群内部或遗传类群间自交系杂交的亲和关系，杂交组合配制的过程中应兼顾遗传类群和SRK单元型。

关键词

羽衣甘蓝; SSR指纹图谱; 自交不亲和; SRK单元型

羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）原产于地中海沿岸，是甘蓝的一个变种，形态和颜色多样化；其作为耐寒的观赏花卉和蔬菜作物，在世界各地广泛种植。品种亲缘关系鉴定是羽衣甘蓝育种中重要的工作，传统的亲缘关系鉴定方法基于表型差异，但在品种表型差异小的情况下，易导致品种鉴定失误，从而影响羽衣甘蓝的育种进程。植物基因组中分布着大量的简单重复序列（SSR，sample sequence repeat），基于这些重复序列设计DNA分子标记，进行PCR检测，根据片段分离情况生成二维数字指纹图谱，再通过聚类方法可对材料的亲缘关系进行快速鉴定及杂种优势群划分，该方法不受环境和人为因素影响。王庆彪等^［

1］基于甘蓝基因组设计了20对SSR核心引物，构建了50个甘蓝代表品种的SSR遗传指纹图谱，实现了甘蓝品种鉴定。李晓娟等^{［参考文献 2

百度学术}2］开发了29对SSR标记并构建了18个球茎甘蓝的遗传指纹图谱，实现了球茎甘蓝间的亲缘关系鉴定。

羽衣甘蓝是一种典型的孢子体自交不亲和植物，花期表现出明显的自交不亲和特征。目前普遍认为，这种自交不亲和性由多态性S位点控制^［

3］，S位点上有编码雌、雄S识别因子的基因，也称为S单元型^{［参考文献 4

百度学术}4］。SRK受体激酶基因是与S位点连锁的三类基因之一，S位点还包括糖蛋白基因（SLG）以及S位点富半胱氨酸蛋白基因（SCR）或S位点蛋白11基因（SP11）。SRK基因^{［参考文献 5

百度学术}5］在雌蕊柱头中表达，作用于花粉和柱头的识别反应^{［参考文献 6

百度学术}6］；SLG基因^{［参考文献 7

百度学术}7］在柱头表皮细胞中表达，作用于自交不亲和反应^{［参考文献 8

百度学术}8］；SCR/SP11基因^{［参考文献 9

百度学术}9］在花药中表达，与柱头中的SRK受体相互作用，触发导致花粉排斥的信号级联反应。基于SRK单元型差异，十字花科的自交不亲和性分为两类：强自交不亲和的Class I型和弱自交不亲和的Class II型^{［参考文献 10

百度学术}10］。

不同SRK单元型材料之间花期授粉能正常结籽，相同SRK单元型材料之间花期授粉不能结籽或结籽率极低，因此，在配置杂交组合时，鉴定自交不亲和系的SRK单元型极为重要。亲和指数法^［

11］常用来评价材料间的配合力和鉴定SRK单元型，但是该方法田间工作量大、测定周期长、效率低；此外，还采用荧光显微法^{［参考文献 12

百度学术}12］、免疫测定法^{［参考文献 13

百度学术}13］和等电聚焦法^{［参考文献 14

百度学术}14］等方法进行SRK单元型鉴定，但是这些方法的应用难度较大。随着分子生物学的发展，分子标记辅助育种技术^{［参考文献 15

百度学术}15］得到了广泛应用，该技术成本低，鉴定时间短。基于已开发的SRK基因特异性分子标记，克隆羽衣甘蓝不同材料的SRK基因，然后在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，可以快速、准确地鉴定分析羽衣甘蓝不同遗传类群的SRK单元型。Nishio等^{［参考文献 16

百度学术}16］基于SRK基因设计了2对可用于Class I型SRK单元型扩增的分子标记PK1/PK4和PK5/PK4。Park等^{［参考文献 17

百度学术}17］开发了用于鉴定Class II型SRK单元型的分子标记KD4/KD7。蓝兴国等^{［参考文献 18

百度学术}18］、田磊等^{［参考文献 10

百度学术}10］和苗雯雯等^{［参考文献 19

百度学术}19］利用Class I型分子标记PK1/PK4和Class Ⅱ型分子标记KD4/KD7，实现了对甘蓝SRK单元型的快速鉴定。后来陈文迪^{［参考文献 20

百度学术}20］发现分子标记PK1/PK4在不同的甘蓝群体中存在条带模糊、不稳定等缺点，因此设计了特异性更强的Class I型引物PKC6F/PKC6R。

本研究利用已开发的20对SSR标记对20个羽衣甘蓝自交系进行PCR扩增及电泳，通过遗传指纹图谱及聚类对自交系间的杂种优势关系进行划分，并利用已开发的2对SRK激酶区特异引物快速准确的鉴定羽衣甘蓝不同遗传类群的SRK单元型，并对不同遗传类群中SRK单元型的分布及花期自交和杂交亲和指数进行分析。通过指纹图谱构建、遗传类群划分及SRK单元型鉴定，为羽衣甘蓝的杂种优势育种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所使用的20份羽衣甘蓝自交系材料（表1），均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝类蔬菜遗传育种创新团队选育。2021年种植在昌平南口中试基地，进行统一的栽培管理。在温室大棚使用64孔穴盘播种育苗，20～30 d后定植于露地，每畦宽100 cm，畦间距30 cm，行距×株距为50 cm×30 cm，每份自交系种植2畦，每畦30棵。定植后采用滴灌浇水，注意缺苗的及时补苗和除草。

表 1 20份羽衣甘蓝自交系的特征

Table 1 Characterization of 20 kale inbred lines

编号 Number	名称 Name	叶色 Leaf color	叶形 Leaf shape
2510	浅紫东林	红紫色	紧凑皱叶、波浪状叶缘
2511	东林紫红	红紫色	紧凑皱叶、波浪状叶缘
2512	名古屋红	红紫色	紧凑皱叶、波浪状叶缘
2515	白鸽	外叶白色、内叶紫色	光滑叶、波浪状叶缘
2519	白鸽	黄白色	光滑叶、波浪状叶缘
2522	东京红	红紫色	光滑叶、波浪状叶缘
2523	名混紫	红紫色	紧凑皱叶、波浪状叶缘
2524	三雄红	红紫色	紧凑皱叶、波浪状叶缘
2526	邹叶白	白色	紧凑皱叶、波浪状叶缘
2528	紫鸽	红紫色	光滑叶、波浪状叶缘
2533	维多利亚鸽	外叶白色、内叶紫色	光滑叶、波浪状叶缘
2535	白孔雀	白色	光滑叶、裂叶叶缘
2536	红孔雀	紫色	光滑叶、裂叶叶缘
2538	白珊瑚	黄白色	光滑叶、波浪状叶缘
2542	红斑鸠	红紫色	光滑叶、波浪状叶缘
2546	双色鸽	外叶白色、内叶紫色	光滑叶、波浪状叶缘
2549	红宝	红色	披散皱叶、波浪状叶缘
2550	苏格兰甘蓝	绿色	披散皱叶、波浪状叶缘
2551	Red bor	红色	披散皱叶、波浪状叶缘
2552	布比甘蓝	绿色	披散皱叶、波浪状叶缘

1.2 基因组DNA的提取与PCR扩增

取成熟期的新鲜甘蓝幼嫩叶片2ｇ装入2 mL收集管中，利用改良的CTAB法提取叶片基因组DNA，利用超微量分光光度计（BioDrop）检测DNA浓度和纯度后备用。

利用王庆彪等^［

1］开发的20对SSR引物对20份羽衣甘蓝材料进行扩增（表2），PCR反应体系为10 μL，包含：200 μg/μL的模板DNA 1.0 μL，2×3G Taq Master Mix for PAGE 5.0 μL（南京诺唯赞生物科技有限公司），正反向引物（5 mmol/L）各0.5 μL（苏州金唯智生物科技有限公司合成），ddH₂O 3.0 μL。PCR反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，72℃彻底延伸5 min，35个循环。配置8%聚丙酰胺凝胶进行电泳，恒压150 V，时间1 h 10 min。最后对page胶进行银染成像保存。

表 2 SSR多态性引物和SRK激酶区特异引物

Table 2 SSR polymorphism primers and SRK gene kinase region specific primers

编号 No.	引物名称 Primer name	正向引物（5′-3′） Forward sequence（5′-3′）	反向引物（5′-3′） Reverse sequence（5′-3′）
#1	BoE188	CGACGATGGCGAGGAAACA	CACATAACCCAAATACCCAAATCA
#2	BoE607	TCTATTCACAACGATTCAACTAAC	CGGTACGGCTGGCTCTT
#3	BoE162	AGCAGCTTCGTTCAATCTCC	CGGCAGCGTATACCTTCACA
#4	BoE966	TCGAATAAAGAAGAAAAAGAAGA	TAATCCCTGGTAAGAGTAGT
#5	BoE222	ACTACCCTCTCCGTTTACTCCACA	GCCCCATAGCTTTCTCAA
#6	BoE718	CAAGAAACGGACGTGGTGAAAG	TCTCGCGTATGGGGCTGTCT
#7	BoE002	CGTCACGGTGGCGCTTTATTTT	ACGACGTCGCCGCACTGAAC
#8	BoE450	TCTCGCCATGGCTGATAAG	TCGGGGCGTTGATTCTCGTCTCT
#9	BoE882	CCGCTTCTTCCTTGCCTTCCT	TTCGCCAGTAGATCCCCGTAATG
#10	BoE699	TCCCCACCCCCAAAAAGAGA	AACGAGCCATCCGAAGAAGAGG
#11	BoE379	GCGGGGACTCTACCTCTA	AGCAGCTCAGCATACAAG
#12	BoE761	CATTCAGCGACTTCCTTCAAACTT	GGCGCACTTCTTCCCCTGTA
#13	BoE723	CGTTGAGGCCGAGAGTGAGAG	ATGGACGCCGGAAATGAGAA
#14	BoE209	ATCTATCCCATCCGCTCGTCA	AACCCCTATTCGCTTACTCC
#15	BoE875	CCGACAATGGCTGGAGTAGG	GATAAGCCGGTAGAGCATAAGGAG
#16	BoE237	AATCCCGAAAAGAGCGAAACC	CTGGGGAGCCGAGAAGGAG
#17	BoE134	CTCTTATTTCTTGTAGGGCTTTTA	CCGTTGGAGATGACTGACTG
#18	BoE734	TCATCCAAAGAAATCAGAGG	ACAGGGAGAAAGAAAAAGAGA
#19	BoE051	GAGTCTTCGTCTTCTTCTTCC	AGTCGCCATTATTAACACCTCTA
#20	BoE917	AACAACCCTTTCCTGACAC	AAAAACCAAAGAACTACAAAATA
#21	Class Ⅰ SRK-K	CAATTTCACAGAGAATAGTGA	ACCATTCCGGATATCCGCATTT
#22	Class Ⅱ SRK-K	GAGGGCGAGAAGATCTTAATT	AAGACKATCATATTACCGAGC

利用陈文迪^［

20］开发的Class I型特异性标记PKC6F/PKC6R和Park等^{［参考文献 17

百度学术}17］开发的Class II型特异性引物KD4/KD7对SRK基因激酶区的DNA片段进行扩增（表2的#21和#22）。为提高效率，两对引物加入同一PCR反应体系（11 μL），200 μg/μL的模板DNA 1.0 μL，2×Accurate Taq Master Mix 5.0 μL（湖南艾科瑞生物工程有限公司），正反向引物（5 mmol/L）各1 μL，ddH₂O 3.0 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性30 s； 98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸（PKC6F/PKC6R为45 s，KD4/KD7为1 min 15 s），72 ℃彻底延伸2 min，35个循环。PCR扩增产物利用配制的1%的琼脂糖凝胶进行电泳，恒压150 V 20 min。利用紫外凝胶成像仪系统进行拍照记录保存。

1.3 SSR指纹图谱构建及遗传类群划分

根据20个羽衣甘蓝自交系的SSR扩增结果，统计变异位点和基因型，0表示无扩增，1表示有扩增，人工读带构建二元0、1数字指纹图谱。指纹编码方式为“引物序号_0/1”，如#6_010表示编号为#6标记的3个变异位点编码分别为0、1、0。计算引物的多态信息含量（PIC，polymorphism information content）值，并利用NTSYSY软件中的等权重算术平均聚类（UPGMA，unweighted pair group method with arithmetic mean）方法对数字指纹进行聚类分析，对材料进行遗传类群划分。多态信息含量计算公式如下。

H_j = ∑P_i²j=1，2，3，...，n；i=1，2，3，...，n

其中，H_j表示第j对引物的PIC值，P_i表示第i个等位基因的基因频率。

1.4 SRK基因测序分析

将PCR反应液用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）进行纯化回收、连接pEASY-T1 Cloning Vector载体（北京全式金生物技术股份有限公司）、涂LB培养基、挑单克隆菌和摇菌后送苏州金唯智生物科技有限公司测序，测序完成后，在NCBI数据库中BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.gov/Blast.cgi）比对，根据SRK基因序列覆盖度和相似性确定20份羽衣甘蓝材料的SRK单元型。

1.5 亲和指数测定

在不同遗传类群各选择2份自交系进行自交，包括Class Ⅰ型SRK单元型和Class Ⅱ型SRK单元型，在遗传类群中和遗传类群间选取1~2份自交系进行杂交，包括Class Ⅰ型不同SRK单元型间的杂交、Class Ⅰ型和ClassⅡ型SRK单元型间的杂交。通过花期人工授粉后，统计授粉花朵数，待种荚成熟后逐一考种，计算花期自交和杂交亲和指数。亲和指数表示为花期自交结籽数、杂交结籽数分别占授粉总朵数的百分率。3次生物学重复，采用SPSS 26软件和Excel软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 SSR引物多态性分析

利用王庆彪等^［

1］开发的20对用于甘蓝遗传背景鉴定的SSR引物对20份羽衣甘蓝自交系进行了PCR检测，结果发现，20对SSR引物在20份材料中，共鉴定到65个等位变异，平均每个位点含有3.25个等位变异，其中高多态性引物有11对（等位变异数大于或等于3），包括BoE607、BoE162、BoE966、BoE718（图1）、BoE882、BoE699、BoE209、BoE875、BoE734、BoE051和BoE917，分别有5个、7个、3个、3个、6个、6个、4个、4个、3个、3个和3个变异位点，多态信息含量在0.4~0.83之间。以上结果说明这套SSR引物对20份羽衣甘蓝自交系的鉴别能力较强。

图 1 SSR引物BoE718对20份羽衣甘蓝自交系的扩增结果

Fig. 1 Amplification results of SSR primer BoE718 on 20 kale inbred lines

M：2000 bp DNA Marker，1、2和3表示3个不同的等位变异；材料编号同表1，下同

Different allelic variants are represented by 1，2 and 3； Material numbers are the same as in Table 1， the same as below

2.2 羽衣甘蓝遗传指纹图谱构建与遗传类群划分

将20对SSR引物扩增结果转换为0和1的二元矩阵，其中1代表扩增条带存在，0代表条带的缺失。基于这些标记位点，首次构建了羽衣甘蓝自交系的SSR遗传指纹图谱（图2），显示了各个自交系间的多态性。为进一步分析自交系之间的遗传关系，基于二元矩阵数据进行系统聚类分析，使用UPGMA聚类算法对羽衣甘蓝自交系进行聚类。结果显示，在遗传相似系数为0.558处将羽衣甘蓝自交系聚类为3个遗传类群：类群OK1、类群OK2和类群OK3（图3）。遗传类群中所有自交系在同一SSR分子标记的指纹相同，即表示该指纹与遗传类群高度相关。通过指纹图谱分析，与遗传类群OK1高度相关的指纹有#5_10、#9_010101和#16_10；与遗传类群OK2高度相关的指纹有#6_010、#9_101010、#11_10、#12_01、#14_1111、#15_01、#16_10、#17_100和 #19_001；与遗传类群OK3高度相关的指纹有#5_10和#7_10；此外，特异指纹分析显示，遗传类群OK1中，指纹#2_01100、#10_010000和#14_1000分别在材料2549、2550和2551中特异；遗传类群OK2中，指纹#10_110000在材料2535中特异；遗传类群OK3中，指纹10_110111和13_0111在材料2536中特异，指纹#14_1001在材料2546中特异（表3和图4）。

图2 20份羽衣甘蓝自交系的SSR指纹图谱数据库

Fig. 2 SSR finger-printing database of 20 kale inbred lines

蓝色和绿色方块分别代表1和0，数字1～65代表不同的变异位点

The blue and green square represent the value 1 and 0， respectively， numbers1-65 represent different mutation sites

图 3 羽衣甘蓝自交系二元矩阵聚类

Fig. 3 Binary matrix cluster of kale inbred lines

表 3 20份羽衣甘蓝自交系的数字0，1矩阵

Table 3 Digital 0， 1 matrix of 20 kale inbred lines

遗传类群 Genetic group	编号 Number	#1_#2_____#3____#4___#5_#6_#7_#8__#9____#10___#11_#12_#13_#14_#15_#16_#17_#18_#19_#20
OK1	2510	10_00111_0010011_001_10_100_10_01_010101_001000_10_01_0110_1100_10_10_100_010_001_10
	2511	10_00111_1010100_001_10_100_10_01_010101_001000_10_10_0110_1100_10_10_100_010_001_01
	2512	01_11100_1010100_001_10_001_10_01_010101_001000_10_10_1000_1100_01_10_100_100_001_10
	2523	01_00110_1010100_100_10_001_10_10_010101_001000_10_10_0110_1100_01_10_100_100_001_10
	2524	01_00110_1010100_100_10_001_10_01_010101_001000_10_10_1101_1100_10_10_100_100_001_01
OK1	2526	01_11100_0101010_001_10_100_10_10_010101_001000_10_01_0110_1100_10_10_100_100_010_10
	2549	10_01100_1010100_011_10_100_01_01_010101_001000_01_10_0110_1100_10_10_100_010_010_01
	2550	10_00111_1010100_011_10_001_01_10_010101_010000_10_01_1000_1111_10_10_010_100_010_10
	2551	10_01110_1010100_010_10_100_01_01_010101_001000_01_10_0110_1000_10_10_100_100_010_01
	2552	10_00110_1010100_010_10_100_01_10_010101_001000_10_10_1000_1111_10_10_100_010_010_10
OK2	2515	01_11100_1010100_001_01_010_01_01_101010_001000_10_01_1000_1111_01_10_100_001_001_10
	2519	01_11100_0101010_001_01_010_01_01_101010_001000_10_01_0110_1111_01_10_100_010_001_01
	2533	10_01110_0101010_010_01_010_10_10_101010_110001_10_01_0110_1111_01_10_100_001_001_01
	2535	10_00111_1010100_001_10_010_01_01_101010_110000_10_01_0110_1111_01_10_100_001_001_10
	2538	01_00111_1010100_001_10_010_01_01_101010_001000_10_01_1000_1111_01_10_100_001_001_10
OK3	2522	10_00110_0101010_001_10_001_10_10_101010_001000_00_10_0110_1100_10_10_011_001_100_10
	2528	10_00110_0101010_001_10_010_10_10_101010_110001_10_10_0110_1111_10_10_011_001_100_10
	2536	10_00111_0101010_010_10_010_10_01_010101_110111_10_01_0111_1111_01_10_100_010_100_10
	2542	01_00110_1010100_010_10_001_10_01_101010_110001_10_10_0110_1111_10_01_010_001_100_10
	2546	01_00111_0101010_100_10_010_10_01_101010_001000_10_01_0110_1001_10_10_010_010_010_01

#1～#20为引物编号，与表2同；不同的列对应20对标记的65个等位变异，指纹编码方式为引物序号_0/1；红色为7个特异指纹

Primers #1 to #20 are the same as in Table 2； Different columns represent 65 allelic variations across the 20 pairs of markers，the fingerprint encoding format is primer-number_0/1； Seven unique fingerprint have been labeled in red

图4 指纹与遗传类群相关性分析

Fig. 4 Correlation analysis of fingerprint and genetic group

A：OK1；B：OK2；C：OK3；红色部分为与遗传类群高度相关的指纹

The red portion represents fingerprints highly correlated with genetic groups

遗传类群OK1包括10个自交系，叶色以红紫色为主，叶形为紧凑皱叶或者披散皱叶，波浪状叶缘，包括自交系2510、2511、2512、2523、2524、2526、2549、2550、2551和2552，其中前5个自交系的表型高度相似。遗传类群OK2和OK3均为光滑叶，叶缘包括波状和裂叶，遗传类群OK2包括自交系2515、2519、2533、2535和2538，其中自交系2515和2533的表型相似，自交系2519和2538的表型相似；遗传类群OK3包括2522、2528、2536、2542和2546，其中自交系2522、2528和2542表型高度相似。另外遗传类群OK2基本为白色外叶，遗传类群OK3基本为红紫色叶。

2.3 羽衣甘蓝不同遗传类群SRK单元型鉴定

利用基于SRK基因设计的Class Ⅰ型SRK单元型特异标记PKC6F/PKC6R与Class Ⅱ型SRK单元型特异标记KD4/KD7，对羽衣甘蓝3个遗传类群不同自交系进行扩增，如图5所示，Class Ⅰ型SRK单元型的目的条带为480 bp，Class Ⅱ型SRK单元型的目的条带为1100 bp，最终在羽衣甘蓝自交系中共鉴定到13份纯合Class Ⅰ型SRK单元型材料和7份纯合Class Ⅱ型SRK单元型材料。

图 5 特异引物PKC6F/PKC6R和KD4/KD7的PCR扩增结果

Fig. 5 PCR amplification results of specific primers PKC6F/PKC6R and KD4/KD7

将PKC6F/PKC6R和KD4/KD7的扩增产物进行测序，在NCBI数据库中进行BLAST分析，确定不同材料的SRK单元型。结果发现，羽衣甘蓝3个遗传类群共包括9个不同的SRK单元型，遗传类群OK1包括SRK7、SRK14、SRK15、SRK23和SRK45，遗传类群OK2包括SRK15、SRK16和SRK51，遗传类群OK3包括SRK13、SRK23、SRK36和SRK45；除SRK15、SRK23和SRK45外，其余6个SRK单元型特异分布在不同的遗传类群中（表4）。

表 4 基于UPGMA聚类分析对20个羽衣甘蓝自交系分组

Table 4 Grouping of 20 kale inbred lines based on UPGMA cluster analysis

类群Cluster	材料Materials	SRK单元型SRK haplotype	类群Cluster	材料Materials	SRK单元型SRK haplotype
OK1	2510	SRK15	OK2	2515	SRK51
	2511	SRK15		2519	SRK15
	2512	SRK23		2533	SRK15
	2523	SRK23		2535	SRK16
	2524	SRK14		2538	SRK16
	2526	SRK45	OK3	2522	SRK23
	2549	SRK15		2528	SRK23
	2550	SRK15		2536	SRK45
	2551	SRK15		2542	SRK13
	2552	SRK7		2546	SRK36

2.4 羽衣甘蓝不同遗传类群SRK单元型分布及叶形叶色分析

分析不同遗传类群羽衣甘蓝自交系的SRK单元型分布，结果发现，Class Ⅰ型SRK单元型和ClassⅡ型S单元型在不同遗传类群中存在明显差异（表5）。遗传类群OK1的5种SRK单元型中，有4种为Class Ⅰ型（SRK7、SRK14、SRK23和SRK45），共5份自交系；1种为Class Ⅱ型（SRK15），包含5个自交系，占OK1类群的50%。遗传类群OK2的3种SRK单元型中，包括SRK16和SRK51两种Class Ⅰ型SRK单元型，分别有2份和1份自交系，该类群中Class Ⅰ型SRK单元型材料占主导地位，OK2中也存在1种Class Ⅱ型SRK单元型（SRK15）。遗传类群OK3的4种SRK单元型均为ClassⅠ型，包括SRK13、SRK23、SRK36和SRK45，共5份材料。综上，高代自交不亲和系育种可能会使Class Ⅱ型SRK单元型逐渐丧失，不利于维持Class Ⅰ型和Class Ⅱ型SRK单元型间平衡和SRK单元型的多样性。

表 5 20个羽衣甘蓝自交系SRK单元型的分布

Table 5 Distribution of SRK haplotypes in 20 kale inbred lines

类群Cluster	S单元型 S haplotype	类型 Type	数量 Quantity
OK1	SRK7	Class Ι型	1
	SRK14	Class Ι型	1
	SRK15	Class Ⅱ型	5
	SRK23	Class Ι型	2
	SRK45	Class Ι型	1
OK2	SRK15	Class Ⅱ型	2
OK2	SRK16	Class Ι型	2
	SRK51	Class Ι型	1
OK3	SRK13	Class Ι型	1
	SRK23	Class Ι型	2
	SRK36	Class Ι型	1
	SRK45	Class Ι型	1

叶形叶色分析发现，遗传类群OK1的5种SRK单元型叶缘均为波浪状，SRK15单元型包括5份自交系（2510、2511、2549、2550和2551），占50%，其中2510和2511的叶色叶形为红紫色紧凑皱叶，2549和2551为红色披散皱叶，2550为绿色披散皱叶；SRK23单元型包括2份自交系（2512和2523），占20%，均为红紫色紧凑皱叶；SRK14、SRK7、SRK45单元型均只包括1份自交系（分别为2524、2552、2526），均占10%，分别为红紫色紧凑皱叶，绿色披散皱叶和白色紧凑皱叶。遗传类群OK2的3种SRK单元型均为光滑叶，SRK15单元型包括2份自交系（2519和2533）均为波浪状叶缘，分别为黄白色叶和外白内紫色叶，占40%；SRK16单元型包括两份自交系（2535和2538），分别为白色叶、裂叶叶缘和黄白色叶、波浪状叶缘，占40%；SRK51单元型只包括1份自交系（2515），占20%，为外白内紫色叶、波浪状叶缘。遗传类群OK3的4种SRK单元型均为光滑叶，SRK23单元型包括两份自交系（2522和2528），占40%，均为红紫色叶、波浪状叶缘；SRK13、SRK36、SRK45单元型均只包括1份自交系（分别为2542、2546、2536），均占20%，分别为红紫色叶、波浪状叶缘，外白内紫色叶、波浪状叶缘和紫色叶、裂叶叶缘（表1）。

2.5 羽衣甘蓝自交系花期自交/杂交亲和性验证

通常认为花期亲和指数在0.5或1以下为强自交不亲和系，在1~3之间为弱自交不亲和系，3~10之间为弱自交亲和系，10以上为强自交亲和系^［

11］。挑选羽衣甘蓝不同遗传类群材料进行自交和杂交，分别有6个杂交和6个花期自交（表6）。6份自交系的花期自交测定结果发现，属于Class Ⅰ型SRK单元型的5份自交系均表现强自交不亲和，属于Class Ⅱ型SRK单元型的1份自交系表现弱自交亲和，亲和指数达到5.74。Class Ι型相同SRK单元型材料间杂交表现为强不亲和，不同SRK单元型材料杂交表现为强亲和，且所有Class Ι型SRK单元型材料与Class Ⅱ型SRK15单元型材料杂交均表现为强亲和。因此，在配制羽衣甘蓝杂交组合时，在优先考虑不同遗传类群的前提下，兼顾考虑SRK单元型，不配制相同Class Ι型SRK单元型材料间的杂交组合。以SRK23为例，有4份材料属于SRK23单元型，分别是遗传类群OK1的2512、2523和OK3的2522、2528，实际杂交育种过程中应避免这4份材料的任意两两杂交。其余含有相同Class Ι型SRK单元型的两组材料（2526和2536、2535和2538）也应避免配制杂交组合。

表 6 不同羽衣甘蓝自交系的自交、杂交亲和指数

Table 6 Compatible index of self-pollination or cross-pollination with different kale inbred lines

类型 Type	自交系或杂交组合 Inbred line or hybrid combination	遗传类群Genetic cluster	花朵数Number of flowers	种子数Seed number	亲和指数 Compatible index
花自交 Flowering self-pollination	2546（SRK36）	OK3	18	0	0i
	2524（SRK14）	OK1	14	1	0.07i
	2535（SRK16）	OK2	19	2	0.11i
	2542（SRK13）	OK3	18	13	0.72g
	2538（SRK16）	OK2	16	12	0.75g
	2510（SRK15）	OK1	23	132	5.74f
杂交 Flowering cross-pollination	2522×2528（SRK23×SRK23）	OK3×OK3	19	6	0.36h
	2546×2515（SRK36×SRK51）	OK3×OK2	17	414	24.35e
	2542×2551（SRK13×SRK15）	OK3×OK1	20	524	26.2d
杂交 Flowering cross-pollination	2523×2519（SRK23×SRK15）	OK1×OK2	15	491	32.73c
	2552×2549（SRK7×SRK15）	OK1×OK1	19	764	40.21b
	2550×2549（SRK15×SRK15）	OK1×OK1	20	885	43.25a

不同字母表示差异显著（P<0.05）

Different letters indicate a significant difference （P<0.05）

3 讨论

在植物的自交不亲和性中，S单元型和遗传背景之间存在密切的关系，S单元型是植物自交不亲和性的关键因素，它们位于植物基因组中的特定位点，并影响花粉和雌蕊之间的亲和性^［

21］，而遗传背景则反应了个体的遗传构成，包括基因型、遗传多样性以及遗传结构等。研究表明，S单元型在不同遗传背景的甘蓝品种中呈不均匀分布，而不同S单元型的基因频率也不尽相同，导致了S单元型在遗传过程中有了优势和弱势之分，不同的遗传背景可能导致甘蓝群体具有特异的优势S单元型分布，从而影响自交不亲和性的表现，同时育种方式的不同会使甘蓝群体丢失弱势S单元型而积累优势S单元型^{［参考文献 20

百度学术}20］。因此，理解S单元型与遗传背景之间的关系对于揭示甘蓝自交不亲和性的遗传机制具有重要意义。未来的研究可以进一步探讨不同遗传背景对S单元型分布的影响，及其在甘蓝育种中维持S单元型多样性的重要价值。

SSR标记因具有基因组分布广泛、数量丰富、重复性好、多态性高、共显性和成本低等优点而被广泛应用于亲缘关系分析、遗传图谱构建和基因定位等研究^［

1-2，22-25］。传统的遗传背景鉴定方法是基于材料的表型差异，存在费时费力和材料表型差异小时鉴定困难等缺点，而利用SSR分子标记可快速可靠的实现材料遗传背景的鉴定。谭晨等^{［参考文献 26

百度学术}26］和郭宁等^{［参考文献 27

百度学术}27］分别利用20对和46对SSR引物对羽衣甘蓝品种进行了亲缘关系和遗传多样性分析，但没进行自交不亲和S单元型的鉴定。本研究首先利用20对SSR引物对20份羽衣甘蓝自交系进行扩增，首次构建了20份羽衣甘蓝自交系的数字指纹遗传图谱，并通过UPGMA聚类方法将其聚类为3个遗传类群（OK1、OK2和OK3），遗传类群OK1的材料均为皱叶，遗传类群OK2和OK3的材料均为光滑叶，且叶形叶色相似的材料有聚在一起的趋势，后续又利用PKC6F/PKC6R和KD4/KD7引物鉴定出20份羽衣甘蓝材料有9种SRK单元型，为羽衣甘蓝的杂种优势育种中的杂交组合配置提供了参考。

植物的自交不亲和性按花的形态分为同型花蕊型自交不亲和（Homomorphic self-incompatibility）和异型花蕊型自交不亲和（Heteromorphic self-incompatibility）^［

28］。同型花蕊型自交不亲和又可分为配子体型自交不亲和（GSI，gametophytic self-incompatibility）和孢子体型自交不亲和（SSI，saprophytic self-incompatibility）^{［参考文献 29

百度学术}29］。羽衣甘蓝属孢子体型自交不亲和植物，当孢子体型自交不亲和发生时，花粉与柱头乳突细胞之间会形成大量的胼胝质抑制受精^{［参考文献 20

百度学术}20］。SRK是与自交不亲和位点连锁的3个基因之一，其单独表达就能使植株表现为自交不亲和^{［参考文献 30

百度学术}30］。迄今为止，甘蓝中基于SRK基因鉴定到的SRK单元型有50多个。通过SRK基因特异标记可将芸薹属自交不亲和性分为Class I型和Class Ⅱ型，前者自交不亲和，后者自交亲和^{［参考文献 31

百度学术}31］。郑敏等^{［参考文献 32

百度学术}32］用SRK特异标记PK1/PK4、KD4/KD7对23份甘蓝自交不亲和系进行了SRK单元型鉴定，发现7份Class I、Class Ⅱ型杂合材料，16份Class I型纯合材料，同一自交不亲和系作为母本与不同单倍型材料杂交后出现结籽数量差异大的现象。Chen等^{［参考文献 33

百度学术}33］发现PK1/PK4引物存在不稳定情况，开发了新的SRK基因特异Class I型引物PKC6F/PKC6R，并结合前人开发的Class Ⅱ型引物KD4/KD7对58份越冬甘蓝材料进行了SRK单元型鉴定，发现了15份Class II型SRK单元型材料和43份Class I型SRK单元型材料，而羽衣甘蓝中SRK单元型鉴定的报道较少。本研究利用2对SRK基因激酶区特异引物对羽衣甘蓝不同遗传类群的SRK单元型进行了鉴定，发现SRK15单元型主要分布在遗传类群OK1中。通过亲和指数分析，发现Ι型SRK单元型材料自交表现为不亲和，Ⅱ型SRK15单元型材料自交表现为亲和，不同SRK单元型材料杂交表现为亲和，且所有Class Ι型SRK单倍型材料与Class Ⅱ型SRK15单元型材料杂交均表现为亲和。Class Ⅱ型SRK15单元型材料可利用蜜蜂授粉，避免人工蕾期授粉繁殖亲本，大大节省制种成本。对于杂交种的组配，可选用不同SRK单元型材料间的杂交组合，以避免材料间发生杂交不亲和。

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