油菜种质<bold>M196</bold>对<bold>ALS</bold>类除草剂的交互抗性评价与抗性基因<bold>BnAHAS1-3R</bold>的表达分析

卢鑫宇; 郭月; 祁余容; 王婷; 李伟龙; 吕欣蕾; 钟詹斐; 彭琦; 高建芹; 张洁夫; 胡茂龙; LU Xinyu; GUO Yue; QI Yurong; WANG Ting; LI Weilong; LYU Xinlei; ZHONG Zhanfei; PENG Qi; GAO Jianqin; ZHANG Jiefu; HU Maolong

网刊加载中。。。

使用Chrome浏览器效果最佳，继续浏览，你可能不会看到最佳的展示效果，

确定继续浏览么?

复制成功，请在其他浏览器进行阅读

油菜种质M196对ALS类除草剂的交互抗性评价与抗性基因BnAHAS1-3R的表达分析 PDF

- ORCID：
卢鑫宇 ^1,2
✉
- ORCID：
郭月 ²
- ORCID：
祁余容 ^2,3
- ORCID：
王婷 ^1,2
- ORCID：
李伟龙 ^2,3
- ORCID：
吕欣蕾 ^2,4
- ORCID：
钟詹斐 ^2,3
- ORCID：
彭琦 ²
- ORCID：
高建芹 ²
- ORCID：
张洁夫 ²
- ORCID：
胡茂龙 ^1,2,3,4
✉

1. 江苏大学生命科学学院，镇江 212013； 2. 江苏省农业科学院经济作物研究所/国家油料作物改良中心南京分中心/农业农村部长江下游棉花与油菜重点实验室/江苏省农业生物学重点实验室，南京 210014； 3. 福建农林大学农学院，福州 350002； 4. 南京农业大学农学院，南京 210095

最近更新：2024-12-06

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240319002

目录contents

摘要

为明确抗ALS类除草剂油菜新种质M196的除草剂交互抗性效应及其抗性基因BnAHAS1-3R的功能，本研究以抗性油菜M196及野生型N131为材料，在油菜苗期3~5叶期，按照田间推荐使用浓度0×、1/4×、1/2×、1×、2×、4×的磺酰脲（SU）、磺酰胺羧基三唑啉酮（SCT）、咪唑啉酮（IMI）、三唑嘧啶（TP）和嘧啶水杨酸（PB）等5种ALS抑制剂除草剂进行喷施处理，鉴定评价M196对各类除草剂的抗性效应。结果表明，M196对SU和SCT除草剂交互抗性最强，对IMI、TP和PB抗性较低。大田鉴定进一步验证了温室交互抗性结果。转抗性基因BnAHAS1-3R拟南芥功能验证表明，转基因阳性植株对各除草剂交互抗性与油菜M196的抗性趋势一致。qRT-PCR分析与转基因拟南芥体外酶活抑制试验结果均表明，M196对ALS类除草剂交互抗性的产生，是由突变靶基因BnAHAS1-3R的表达量增加以及突变靶标酶对除草剂的敏感性下降导致。研究结果为预防和解决利用抗性基因选育的品种大面积推广后可能带来的杂草抗药性以及抗性基因漂移等问题提供了理论依据。

关键词

甘蓝型油菜; 抗除草剂新种质; 交互抗性; 功能分析

油菜是世界四大油料作物之一，是我国第一大油料作物，菜籽油占我国国产食用植物油来源的半数以上。然而，田间杂草伴随油菜整个生长周期，与之争夺阳光、水分、养分、携带病虫害，可导致油菜减产15%~50%，同时带来品质下降，严重危害了油菜产业的高质量发展^［

1-3］。油菜田间杂草主要包括阔叶型杂草、禾本科杂草及其他杂草。在农业现代化进程中，除草剂的化学防治是应用最为广泛的杂草防控方法^{［参考文献 4

百度学术}4］，其中ALS类除草剂具有较高的市场占有率，已成为世界应用最广泛的除草剂之一。

ALS除草剂以乙酰乳酸合酶（ALS，acetolactate synthase）为靶标。除草原理主要是阻碍植物支链氨基酸合成，破坏蛋白质代谢，此外除草剂胁迫还能造成植物体内2-酮丁酸或2-氨基丁酸的积累，重要代谢通路中间产物的耗尽以及光合、呼吸作用的破坏等，最终会导致植物死亡从而达到除草目的^［

5］。ALS除草剂以茎叶吸收为主，兼有封闭作用，具有选择性强、低量高效、杀草谱广、控草期长、对哺乳动物和环境安全等优点，在作物大田和非耕地广泛使用^{［参考文献 6

百度学术}6］。ALS除草剂按化学结构可分为5类^{［参考文献 7

百度学术}7］：磺酰脲（SU，sulfonylurea）、磺酰胺羧基三唑啉酮（SCT，sulfonlyaminocarbonyl-triazolinone）、咪唑啉酮（IMI，imidazolinone）、三唑嘧啶类（TP，triazolopyrimidine）、嘧啶水杨酸（PB，pyrimidyl-benzoate）。其中，SU类主要种类有苯磺隆、噻吩磺隆和苄嘧磺隆等，多用于稻、麦和玉米田，用于阔叶杂草的防除；SCT类主要种类有噻酮磺隆和氟唑磺隆等，用于麦田对野燕麦和看麦娘等禾本科杂草和部分阔叶杂草的防除；IMI类主要种类有咪唑乙烟酸、咪唑烟酸、甲咪唑烟酸、甲氧咪草烟等，主要作用于大豆田；TP类主要有五氟磺草胺和双氟磺草胺等，分别用于稻田和麦田，其对已产生SU抗性的杂草也有较好的防效；PB类种类有双草醚和嘧啶肟草醚等，用于稻田防除一年生和多年生杂草。

除草剂交互抗性是一种由于遗传因素改变造成的，能使植物对不同类型除草剂产生抗性的能力^［

8］。多数情况下作物及杂草中ALS除草剂抗性的产生，与基因突变导致ALS靶标酶氨基酸残基改变，进而引起植物对除草剂的敏感性下降有关，或者与ALS基因表达量增加有关。目前已鉴定出的与ALS除草剂抗性产生有关的突变位点主要有：Ala122、Ala205、Asp376、Arg377、Gly654、Pro197、Ser653和Trp574（以拟南芥ALS的氨基酸位置计算，下同）^{［参考文献 4

百度学术}4］。并且植物对ALS抑制除草剂交互抗性水平的差异与ALS靶基因发生突变对应的蛋白氨基酸突变类型有关^{［参考文献 9

百度学术}9］，如Pro197、Trp574位点突变通常会产生较高的SU抗性，但在有些植物中发现其对IMI和TP除草剂^{［参考文献 10-12}10-12］表现为低抗性。Arg377位点改变能使杂草同时获得SU、TP和SCT除草剂抗性，而Asp376位点突变甚至使野慈姑具有5种ALS除草剂抗性^{［参考文献 13-14}13-14］。

M196是从高抗SU除草剂双位点突变新种质DS3和野生型N131杂交得到的F₂代群体中分离出的单位点突变抗性新种质^［

15］。油菜中有BnAHAS1和BnAHAS3两个高度同源的ALS除草剂抗性靶基因^{［参考文献 6

百度学术}6］，M196抗性源于靶基因BnAHAS1对应蛋白的197位点脯氨酸被亮氨酸替换^{［参考文献 15

百度学术}15］。前期研究表明，M196对SU除草剂苯磺隆抗性水平为除草剂推荐使用剂量的2~3倍，对甲基二磺隆抗性水平为1倍的推荐使用剂量，但其对其他几种ALS除草剂抗性还不清楚。本研究以油菜种质M196为研究对象，比较鉴定M196对5类ALS抑制除草剂的交互抗性效应差异，并通过拟南芥转基因试验分析抗性基因BnAHAS1-3R功能。研究结果对进一步筛选抗性材料适用除草剂范围以提高除草效果，以及防治未来抗性品种推广利用可能产生的杂草抗药性和抗性基因漂移等问题都具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试野生型油菜N131和抗ALS类除草剂油菜M196^［

15］种子，皆由江苏省农业科学院经济作物研究所提供。

ALS抑制除草剂共选取10种，属于5个不同大类，每类选取代表性除草剂2种。SU除草剂为苄嘧磺隆和噻吩磺隆，SCT除草剂为噻酮磺隆和氟唑磺隆，IMI除草剂为咪唑乙烟酸和甲氧咪草烟，TP除草剂为双氟磺草胺和五氟磺草胺，PB除草剂为双草醚和嘧啶肟草醚。各除草剂的有效成分含量、田间推荐使用浓度、制造商等信息详见表1，并将田间推荐使用浓度记为1×喷药浓度。

表1 除草剂类别、使用浓度及制造商

Table1 Herbicide categories， concentrations and manufacturer

除草剂类别Herbicide category	除草剂 Herbicide	田间推荐使用浓度 Recommended concentration for field use	对应国标单位浓度 Corresponding to the national standard unit concentration	制造商 Manufacturer
SU	10 % 苄嘧磺隆	20 g/667 m²	0.16 mmol/L	江苏快达农化股份有限公司
SU	25 % 噻吩磺隆	8 g/667 m²	0.17 mmol/L	安徽丰乐农化有限责任公司
SCT	99.5 % 噻酮磺隆	4 g/667 m²	0.34 mmol/L	美国 TMstandard 公司
SCT	70 % 氟唑磺隆	20 g/667 m²	1.12 mmol/L	爱利思达生物化学品北美有限公司
IMI	5 % 咪唑乙烟酸	133 mL/667 m²	0.72 mmol/L	山东先达化工有限公司
IMI	4 % 甲氧咪草烟	80 mL/667 m²	0.35 mmol/L	江苏中旗科技股份有限公司
TP	50 g/L 双氟磺草胺	6 mL/667 m²	2.78 μmol/L	江苏华农生物化学有限公司
TP	25 g/L 五氟磺草胺	80 mL/667 m²	0.34 mmol/L	科迪华农业科技公司
PB	10 % 双草醚	20 mL/667 m²	0.15 mmol/L	海特农化有限公司生产
PB	5 % 嘧啶肟草醚	50 mL/667 m²	0.14 mmol/L	稻农信-青岛闲农抗性杂草防治有限公司

1.2 除草剂配比及喷施方法

生长室内处理：于2023年6月江苏省农科院生长室萌发油菜N131及M196后，移栽至营养土中，置于人工气候室（光照周期14 h光/10 h暗，温度23 ℃）中培养至3~5叶期，分别按照10种除草剂田间推荐使用浓度的0、1/4×、1/2×、1×、2×、4×对油菜幼苗进行茎叶喷施（表1），每个处理3盆重复，每盆4株。

田间处理：于2023年10月在江苏省农科院区试田种植油菜N131及M196。两种材料分区种植，每个小区分为5行。每种材料6个小区对应5类除草剂处理（5小区）以及0×处理组，各除草剂处理小区每个5行分别对应1/4×，1/2×，1×，2×和4× 不同除草剂浓度。行长2 m，行距0.4 m，每行移栽20株四叶一心期油菜幼苗，用一种除草剂的一个浓度进行处理。移栽2周后，茎叶喷施噻吩磺隆、噻酮磺隆、咪唑乙烟酸、双氟磺草胺和双草醚5类除草剂，同类同种浓度除草剂喷施一行，喷施过程中使用挡板进行隔离，避免喷洒到相邻行油菜。

1.3 ALS类除草剂交互抗性鉴定

待N131及M196生长至3~5叶期喷施各除草剂，3周后，采用整株测定法和目测法鉴定油菜抗性水平。将抗性效应等级分为3类：抗性（植株长势良好无明显药害）；中抗（植株受到药害叶片褪绿变黄，但最终未死亡）；敏感（植株死亡）^［

13］。

1.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析

对室内生长至3~5叶期的N131及M196喷施4×田间推荐使用浓度的噻吩磺隆、噻酮磺隆、咪唑乙烟酸、双氟磺草胺和双草醚等除草剂，并在喷施除草剂后的0 h、12 h、24 h摘取新鲜油菜叶片，液氮速冻后保存于-80℃冰箱备用。液氮研磨后使用OminiPlant RNA Kit（全能型植物RNA提取盒）提取叶片RNA，并将RNA浓度统一稀释到500 ng/μL，根据HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix（快速去基因组逆转录预混液）试剂盒说明书逆转录得到cDNA。由于油菜ALS1和ALS3基因编码区序列同源性极高，采用探针法进行qRT-PCR分析以提高准确性，内参基因选用真核翻译起始因子4B（EIF4B）基因^［

15］。20 μL扩增体系：3 μL cDNA、10 μL Mix、共3.6 μL扩增引物、0.8 μL探针引物（p）、2.6 μL ddH₂O。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃ 延伸30 s，40个循环。试验过程包含3个生物学重复及3个技术重复。

qRT-PCR采用ABI7500实时PCR系统（美国应用生物系统公司），涉及引物及探针序列见表2，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，OminiPlant RNA Kit（全能型植物RNA提取盒）和HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix（快速去基因组逆转录预混液）试剂盒购于江苏康为世纪生物科技股份有限公司，结果采用Origin 2021软件绘制。

表2 本研究中所用到的引物序列

Table 2 The primers sequences used in study

引物 Primer	引物序列（5´→3´） Sequence （5´→3´）	用途 Use
ALS1-F1	AGAACAGTTAGATCCAC	基因克隆
ALS1-R1	CAGCTTCATCTCTCAGTA	基因克隆
ALS1-F2*	CGCGGTACCTCATCTCTCTCTCCTCTAACC	载体构建
ALS1-R2*	CGCACTAGTGATCACCAGCTTCATCTCTC	载体构建
ALS1-F2	TTCTCCTTAACCCCACAGAAAGA	qRT-PCR
ALS1-R2	GGGAGCGTAGCGGGAGAC	qRT-PCR
ALS1-P	CCGTCAATGTCGCACCTCCTTCC	qRT-PCR探针
EIF4B-F	GTGAGCTGGACGACAAAGTC	qRT-PCR
EIF4B-R	CTCTGATCATCGGCAGGTCT	qRT-PCR
EIF4B-P	TGCCTGCACCAGACCCGGGT	qRT-PCR探针
UA1-F	GCCCTGCCTTCATACGCTAT	转基因植株PCR鉴定
UA1-R	TCTGCTAACCCGCTGACGAG	转基因植株PCR鉴定

1.5 M196的遗传基因抗性转化及PCR鉴定

根据M196的基因序列BnAHAS1-3R^［

15］，用引物ALS1-F2*/R2*进行PCR扩增，PCR扩增体系：1.0 μL DNA模板、 10 mmol/L引物ALS1-F2*/R2*各1 μL、11.0 μL H₂O、2.0 μL 10×PCR Buffer、2.0 μL 2 mmol/L dNTPs（2 mmol/L dATP，dGTP，dCTP，dTTP each）、1.2 μL 25 mmol/L Mg²⁺、0.8 μL 1 U/L KOD Plus Taq酶。PCR程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。用Kpn I和Spe I双酶切PCR回收产物获得目的片段，通过T4连接酶连接到同样经过双酶切的载体上，获得重组载体pBnAHAS1-3R。转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落测序鉴定。将测序正确的菌液扩繁、保菌后提取质粒并转入根癌农杆菌EHA105菌株，采用农杆菌侵染花序法转化拟南芥，筛选得到纯合株系。

取转基因拟南芥纯合植株新鲜叶片，提取基因组DNA。使用特异性引物UA1-F/R^［

16］，进行PCR鉴定（表2）。PCR扩增体系：1.0 μL DNA模板、10 mmol/L引物UA1-F/R各1 μL、13.0 μL H₂O、2.0 μL 10×PCR Buffer、2.0 μL 2 mmol/L dNTPs（2 mmol/L dATP，dGTP，dCTP，dTTP each）、1.2 μL 25 mmol/L Mg²⁺、0.8 μL 1 U/L KOD Plus Taq酶。PCR程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定^{［参考文献 17

百度学术}17］，纯水作为阴性对照。

1.6 转基因拟南芥ALS类除草剂交互抗性鉴定

选用T₃代拟南芥转基因阳性株系，编号为T2、T3、T4，进行交互抗性鉴定。转基因拟南芥培养3周后，茎叶喷施田间推荐使用浓度的1/4×、1/2×、1×、2×、4×的各类ALS除草剂（噻吩磺隆、噻酮磺隆、咪唑乙烟酸、双氟磺草胺和双草醚）。

1.7 转基因拟南芥体外酶活试验

参照Yoon等^［

18］方法提取ALS粗酶液进行体外酶活试验，以丙酮酸钠为底物，添加浓度梯度0、1、10、50、100、300、500和700 μmol/L的除草剂标准品（噻吩磺隆、噻酮磺隆、咪唑乙烟酸、双氟磺草胺和双草醚），在波长530 nm处测定产物乙偶姻OD值，并根据乙偶姻标准曲线计算相应OD值处乙偶姻的浓度^{［参考文献 16

百度学术}16，19］，试验包含3个生物学及3个技术重复。除草剂标准品99.3 %噻吩磺隆、98 %咪唑乙烟酸、98 %双氟磺草胺、98 %双草醚均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；99.5 %噻酮磺隆购于美国TMstandard公司。

结果采用Microsoft Excel 2007软件进行分析，Origin 2021软件进行绘制。酶活计算公式为：相对酶活（%）=处理组乙偶姻浓度/对照组乙偶姻×100 %。

2 结果与分析

2.1 5类ALS抑制类除草剂交互抗性鉴定

2.1.1 M196室内交互抗性

野生型油菜N131在喷施5类ALS除草剂3周后植株均死亡，抗性种质M196在喷施5类ALS除草剂后表现出不同程度的抗性（图1）。M196在喷施田间推荐使用浓度的1/2倍及更低剂量的5类除草剂时，植株生长不受影响，表现出较好的抗性；当5类除草剂浓度提升至田间推荐使用浓度的4倍时，植株全部死亡。M196对SU及SCT除草剂具有较高的抗性水平，在喷施田间推荐使用浓度的2倍及以下浓度的2种SU除草剂（噻吩磺隆、苄嘧磺隆）及2种SCT除草剂（噻酮磺隆、氟唑磺隆）时，植株能够正常生长。M196对IMI、PB及TP除草剂的抗性水平基本一致，在喷施田间推荐使用浓度的1/2倍及以下浓度时植株正常生长，未受到抑制；当IMI除草剂（咪唑乙烟酸、甲氧咪草烟）、PB除草剂（双草醚、嘧啶肟草醚）及TP除草剂（双氟磺草胺）浓度提升至田间推荐使用剂量的1倍时，植株部分叶片退绿，生长缓慢，明显受到药害，但并未死亡，而TP除草剂五氟磺草胺田间推荐剂量1倍浓度处理后的植株死亡；当施药浓度提升至田间推荐使用浓度的2倍及以上浓度时，植株均死亡，表现与敏感型油菜一致。综上，油菜抗性种质M196对上述5类ALS除草剂抗性水平存在差异，对SU及SCT除草剂抗性较强，而对IMI、TP和PB除草剂抗性较弱。

图1 M196和N131室内喷施5类ALS除草剂3周后交互抗性鉴定结果

Fig. 1 Cross-resistance evaluation of M196 and N131 by spraying five ALS herbicides after 3 weeks in room

S表示经除草剂处理后植株表现敏感；M表示经除草剂处理后植株表现中抗；R表示经除草剂处理后植株表现抗性；0×、1/4×、 1/2×、1×、 2×和4× 分别表示为0、1/4、1/2、1、2和4倍田间推荐施用除草剂浓度，对应国标单位浓度详见表1；下同

S indicates that the plants are sensitive to herbicide treatment； M indicates that plants exhibit mid-resistance after herbicide treatment； R indicates plants confer resistance to herbicide treatment； 0×， 1/4×， 1/2×， 1×， 2× and 4× represent 0， 1/4， 1/2， 1， 2 and 4 times the recommended field concentrations， the corresponding national standard unit concentrations are shown in Table 1 in details； The same as below

2.1.2 M196田间交互抗性

结合油菜抗性种质M196室内交互抗性鉴定结果，分别选用SU除草剂（噻吩磺隆）、SCT除草剂（噻酮磺隆）、IMI除草剂（咪唑乙烟酸）、TP除草剂（双氟磺草胺）、PB除草剂（双草醚）进行喷施处理，设置5个浓度梯度：田间推荐使用浓度的0×，1/4×、1/2×、1×、2×（表1）。在喷施除草剂3周后，对油菜表型进行鉴定。野生型油菜N131在喷施1/4倍及以上浓度的除草剂后均死亡，M196则表现出不同程度的交互抗性（图2~3）。结果表明在喷施1/2倍田间推荐使用浓度的各类除草剂后，M196均能够在田间正常生长不受药害影响。在浓度提升至田间推荐使用浓度的1倍时，双草醚、双氟磺草胺及咪唑乙烟酸对M196植株产生药害，植株叶片变紫但植株未死亡；当喷施田间推荐使用浓度的2倍除草剂时，M196对噻吩磺隆及噻酮磺隆表现抗性，喷施其他3类除草剂的植株均死亡。大田试验结果与室内实验结果基本一致，M196对5类除草剂的交互抗性水平并未因环境的改变而受到较大影响。

图2 5大类ALS抑制除草剂处理3周后N131（A）和M196（B）田间表型

Fig. 2 Phenotype of N131（A） and M196（B） treated with five ALS-inhibiting herbicides after 3 weeks in field

图3 M196和N131田间喷施5类ALS除草剂3周后交互抗性鉴定结果

Fig. 3 Cross-resistance evaluation of M196 and N131 by spraying five ALS herbicides after 3 weeks in field

2.2 抗性基因BnAHAS1-3R的表达分析

为研究油菜抗性种质M196交互抗性的产生与抗性突变基因BnAHAS1-3R表达量之间的关系，分别取喷施4× 各除草剂后0、12、24 h的油菜叶片进行qRT-PCR分析。结果如图4所示，相较于0 h，在喷施5类除草剂24 h时，敏感型油菜N131靶基因表达量均显著下降；而M196靶基因表达量，除SCT除草剂处理组略高（图4B），其余除草剂处理组均下降，但降幅均小于N131，且24 h时 M196的表达量均高于N131。对5类ALS抑制除草剂，M196靶基因表达量的响应程度存在差异。M196对SCT除草剂响应最强（图4B）， 24 h表达量约为0 h时的1.93倍；其次是SU除草剂（图4A）；喷施IMI、PB、TP除草剂24 h时，M196靶基因的表达量相对于12 h显著下降（图4C~E），但表达量仍高于同时间点的N131。这些结果与上述交互抗性鉴定实验的结果基本一致（图1~3），这说明M196对5类ALS除草剂抗性的产生很有可能与其靶基因表达量的上调存在相关性。

图4 油菜N131及M196 ALS1基因对5类ALS除草剂处理后的表达量响应

Fig. 4 Expression of ALS1 genes in N131 and M196 after treated with five ALS herbicides

不同字母表示显著差异（P < 0.05）

Different letters indicate significant differences （P < 0.05）

2.3 转抗性基因的拟南芥交互抗性鉴定

对获得的纯合转基因株系T2、T3、T4进行PCR鉴定（图5），结果表明T2、T3、T4的PCR产物均可扩增到目的片段。进一步通过交互抗性鉴定验证突变体M196中突变基因BnAHAS1-3R的交互抗性功能，野生型拟南芥（Col）在喷施除草剂后株系均死亡，T2、T3、T4抗性结果如图6所示。在喷施田间推荐使用浓度的1/2×及以下浓度的除草剂时，转基因株系均存活，没有受到药害。在喷施田间推荐使用浓度1×的除草剂时，转基因株系对SU及SCT除草剂表现出抗性，而IMI、PB及TP除草剂处理的株系均死亡。2×和4×浓度处理的所有转基因株系均没有抗性，均死亡。结果与油菜的室内和田间抗性鉴定结果基本一致（图1~3），所以M196中抗性突变基因BnAHAS1-3R具有对5类ALS抑制除草剂的交互抗性功能。

图5 转基因拟南芥T2、T3、T4纯合株系的PCR分子鉴定

Fig. 5 PCR molecular identification of T2， T3 and T4 homozygous plants of transgenic Arabidopsis

2、3、4为纯合株系T2、T3、T4；1、5为转基因阴性株系；Col为野生型拟南芥，下同；+为阳性对照质粒；-为阴性对照纯水；M为5000 bp的DNA Marker

2， 3， 4 are homozygous plants T2， T3， T4； 1，5 are transgenic negative plants； Col is wild type of Arabidopsis，the same as below；+：Plasmid of positive control； -：Pure water for negative control； M is DNA Marker of 5000 bp

图6 喷施5类ALS类除草剂3周后转基因拟南芥T2、T3、T4交互抗性鉴定

Fig. 6 Cross-resistance identification in transgenic Arabidopsis T2， T3 and T4 plants after 3 weeks， by spraying with five ALS herbicides

2.4 除草剂处理对转基因拟南芥体外ALS酶活性影响

为了研究转基因拟南芥阳性株系除草剂抗性与ALS酶对各类除草剂的敏感度关系，对野生型拟南芥（Col）和转基因阳性株系T3进行ALS体外酶活抑制试验。从图7中可以看出施加除草剂后，Col及转基因植株的ALS活性都受到了不同程度的影响。使用最高剂量（700 μmol/L）处理后，Col的ALS相对酶活分别为未添加除草剂时的37.24%~59.17%，而T3的ALS相对酶活分别为未加除草剂处理时的61.1%~79.52%，10~700 μmol/L噻吩磺隆、1~700 μmol/L噻酮磺隆、100~700 μmol/L咪唑乙烟酸、10~700 μmol/L双氟磺草胺、50~700 μmol/L双草醚处理组ALS的酶活性皆显著高于其对应Col的酶活性。从图7中可以看出，转基因株系T3的颜色在相同除草剂处理浓度下，均较Col的颜色浅。丙酮比色实验中反应液颜色会随OD530值升高而颜色逐渐变深，颜色越深可以从一定程度上表明其抗性能力越强。结果表明，转基因植株ALS对SCT类除草剂敏感性最低，其次是SU，再次是TP、PB和IMI。以上结果说明，在拟南芥中过表达抗性基因BnAHAS1-3R导致其对各大类除草剂的敏感性下降，最终表现出对5类ALS除草剂的交互抗性。

图7 不同浓度梯度5类ALS除草剂对拟南芥体外ALS酶活性影响

Fig. 7 In vitro ALS activity response to five ALS herbicides with different concentrations in Arabidopsis plants

5种ALS除草剂（噻吩磺隆、噻酮磺隆、咪唑乙烟酸、双氟磺草胺和双草醚）对野生型拟南芥（Col）和阳性纯合株系T3的ALS体外酶活性抑制实验（左）和丙酮比色反应（右）；*和**分别表示Col和T3间差异显著（t检验P<0.05）和差异极显著（t检验P<0.01）

In vitro ALS inhibition experiments （left） and acetone colorimetric reaction （right） of wild-type （Col） and positive homozygous T3 plants after treated with five ALS herbicides （Thifensulfuron， Thiencarbazone-methyl， Imazethapyr， Florasulam and Bispyribac-sodium）； * and ** indicate significant difference between Col and T3 （P<0.05 Student’s t-test） and extremely significant difference （P<0.01 Student’s t-test）， respectively

（图7）

3 讨论

除草剂使用是目前田间防治杂草危害最为广泛的手段之一，但农户在生产过程中滥用、乱用的现象屡见不鲜。除草剂的不合理使用会对油菜等作物生产造成减产、品质降低等问题，进而危害其经济效益^［

20］。通过对已有抗性油菜种质的交互抗性研究，补充其抗性谱，可以帮助规范除草剂的用量及喷施种类。此外，筛选对不同类型除草剂具有同等抗性水平的油菜种质，可以实现不同类型除草剂之间的交替使用，降低杂草抗药性产生，进而延长抗性品种的使用寿命。本研究对自主创制的油菜M196抗性种质进行5类ALS除草剂的抗性效应和表达模式研究，结果表明M196对SU及SCT除草剂具有较高水平的抗性，可以进行除草剂之间的交替使用。抗性基因遗传转化拟南芥后，阳性纯合株系交互抗性鉴定得到了与油菜基本一致的结果。抗性基因的表达模式分析与转基因拟南芥的体外酶活抑制实验表明，ALS除草剂交互抗性的产生是突变靶基因BnAHAS1-3R的表达量增加以及突变靶标酶对除草剂的敏感性下降导致。目前，本单位利用M196、M342、DS3和5N等抗性种质中的基因作为抗性供体，已育成宁R101、宁R201、惠农油、金地油1号和苏R001等系列油菜抗性新品种，它们对SU抗性水平均达田间推荐使用浓度的4倍以上，目前在生产上大面积示范推广应用。

植物对ALS除草剂的交互抗性效应与靶标酶突变位点的氨基酸取代突变密切相关。萤蔺草的ALS靶蛋白197位点脯氨酸被组氨酸或丝氨酸取代时，对苄嘧磺隆和噻吩磺隆（SU）产生抗性，但对IMI和PB敏感；但当197位点脯氨酸被亮氨酸取代时，对SU和PB产生交互抗性，但对IMI敏感^［

21］。野生芥菜ALS靶蛋白的574位点色氨酸被亮氨酸取代后，对IMI和SU产生交互抗性^{［参考文献 22

百度学术}22］，播娘蒿ALS靶蛋白的197位点脯氨酸被组氨酸、丝氨酸、苏氨酸和亮氨酸取代后，对SU、TP和SCT产生交互抗性，对IMI和PB敏感；而播娘蒿的574位点色氨酸突变成亮氨酸后，对5类ALS抑制剂除草剂均能产生交互抗性^{［参考文献 23

百度学术}23］。前期对自主创制的抗性突变体PN19的研究表明，ALS靶蛋白574位点色氨酸突变成亮氨酸后，PN19对SU和SCT交互抗性较强，为推荐除草剂用量的2倍左右；IMI和TP其次，为推荐除草剂用量的1倍左右；PB最低为推荐除草剂用量的1/2倍左右^{［参考文献 24

百度学术}24］。而本研究中油菜抗性种质M196的197位点脯氨酸被亮氨酸取代后，对SU和SCT交互抗性最强，为推荐除草剂用量的2倍左右；而对IMI、TP和PB的交互抗性较差，为推荐除草剂用量的1/2~1倍左右。此外，PN19和M196都是油菜BnAHAS1靶基因上发生不同位置的单点突变，但是在对ALS除草剂的各大类型之间产生的交互抗性表型存在较大差异，此种现象的产生可能是突变位点在靶蛋白的三级结构中的位置差异以及突变前后的氨基酸差异所导致^{［参考文献 8

百度学术}8，15］。

油菜与很多近缘种杂草具有不同程度的天然杂交亲和性，导致具有除草剂抗性的油菜在种植过程中有可能发生基因漂移^［

25］。这种现象会导致抗性基因在近缘种间流动，可能诱发生态风险。抗性基因转移至近缘种杂草后，受体杂草很可能演变为空间内优势种群，导致植物种群单一以及田间生态脆弱。并且抗性基因进入杂草后，一旦出现对除草剂的免疫，变为“超级杂草”，会严重危害农业生产，将造成巨大经济损失^{［参考文献 26

百度学术}26］。而通过交互抗性的研究，可以利用突变基因响应较弱的除草剂种类，防除发生基因漂移的受体杂草。本研究表明M196对IMI、TP、PB除草剂抗性水平较低，可以将喷施这3大类除草剂作为解决BnAHAS1-3R基因漂移问题的有效手段。

参考文献

张立伟. 2021年菜籽菜油菜粕市场分析与2022年展望. 粮油与饲料科技， 2022， 187（3）： 43-48 [百度学术]

Zhang L W. Market analysis of rapeseed meal in 2021 and outlook in 2022. Grain Oil and Feed Technology， 2022， 187（3）： 43-48 [百度学术]

王汉中. 我国油菜产业发展的历史回顾与展望. 中国油料作物学报， 2010， 32（2）： 300-302 [百度学术]

Wang H Z. Historical review and prospect of the development of rape industry in China. Chinese Journal of Oil Crop Sciences， 2010， 32（2）： 300-302 [百度学术]

刘忠松，官春云，陈社员. 抗除草剂油菜研究及其进展. 作物研究， 2003， 17（2）： 70-72 [百度学术]

Liu Z S， Guan C Y， Chen S Y. Research and progress of herbicide-resistant rapeseed. Crop Research， 2003， 17（2）： 70-72 [百度学术]

管文杰，张付贵，闫贵欣，马启铭，伍晓明. 油菜抗除草剂机理与种质创制研究进展. 中国油料作物学报， 2021， 43（6）： 1159-1173 [百度学术]

Guan W J， Zhang F G， Yan G X， Ma Q M， Wu X M. Research progress of herbicide resistance mechanism and germplasm creation in rapeseed. Chinese Journal of Oil Crop Sciences， 2021， 43（6）： 1159-1173 [百度学术]

Zhou Q， Liu W ， Zhang Y， Kevin K. Action mechanisms of acetolactate synthase-inhibiting herbicides. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2007， 89（2）： 89-96 [百度学术]

Hu M L， Pu H M， Kong L N， Gao J Q， Long W H， Chen S. Molecular characterization and detection of a spontaneous mutation conferring imidazolinone resistance in rapeseed and its application in hybrid rapeseed production. Molecular Breeding， 2015， 35（1）： 1-13 [百度学术]

Guo Y， Cheng L， Long W H， Gao J Q， Zhang J F， Chen S. Synergistic mutations of two rapeseed AHAS genes confer high resistance to sulfonylurea herbicides for weed control. Theoretical and Applied Genetics， 2020， 133（10）： 2811-2824 [百度学术]

Powles S B， Preston C. Herbicide cross resistance and multiple resistance in plants. Australia： Herbicide Resistance Action Committee， 2016 [百度学术]

毕亚玲. 小麦田日本看麦娘对精噁唑禾草灵和甲基二磺隆的抗性研究. 泰安：山东农业大学， 2014 [百度学术]

Bi Y L. Resistance of Alopecurus japonicas to fenxaprop-p-ethyl and mesosulfuron-methyl in winter wheat fields. Taian： Shandong Agricultural University， 2014 [百度学术]

吴元龙，惠凤娇，潘振远. 后基因组时代发展抗除草剂作物的机遇及挑战. 中国农业科学， 2023， 56（17）： 3285-3301 [百度学术]

Wu Y L， Hui F J， Pan Z Y. Opportunities and challenges for developing herbicide-resistance crops in the post-genomic era. Science Agricultural Sinica， 2023， 56（17）： 3285-3301 [百度学术]

Chen L， Gu G， Wang C X， Chen Z F， Yan W， Jin M， Xie G， Zhou J L， Deng W X. Trp₅₄₈Met mutation of acetolactate synthase in rice confers resistance to a broad spectrum of ALS-inhibiting herbicides. The Crop Journal， 2021， 9： 750-758 [百度学术]

Li H T， Li J J， Zhao B， Wang J， Yi L C， Liu C， Wu J S， King Graham， Liu kede. Generation and characterization of tribenuron-methyl herbicide-resistant rapeseed （Brassica napus） for hybrid seed production using chemically induced male sterility. The Original and Applied Genetics， 2015， 128： 107-118 [百度学术]

Barrell P J， Latimer J M， Baldwin S J， Thompson M L， Jacobs J M E， Conner A J. Somatic cell selection for chlorsulfuron-resistant mutants in potato： Identification of point mutations in the acetohydroxyacid synthase gene. BMC Biotechnology， 2017， 17： 49 [百度学术]

Hu M L， Pu H M， Gao J Q， Long W H， Chen F， Zhou X Y， Zhang W， Peng Q， Chen S， Zhang J F. Inheritance and molecular characterization of resistance to AHAS-inhibiting herbicides in rapeseed. Journal of Integrative Agriculture， 2017， 16（11）： 2421-2433 [百度学术]

Guo Y， Liu C， Long W H， Ghao J Q， Zhang J F， Chen S， Pu H M， Hu M L. Development and molecular analysis of a novel acetohydroxyacid synthase rapeseed mutant with high resistance to sulfonylurea herbicides. The Crop Journal， 2022， 10（1）： 56-66 [百度学术]

Guo Y， Wang T， Lu X， Li W， LV X， Peng Q， Zhang J， Gao J， Hu M. Comparative genome-wide analysis of circular RNAs in Brassica napus L.： Target‑site versus non‑target‑site resistance to herbicide stress. Theoretical and Applied Genetics， 2024， 137（7）： 176 [百度学术]

刘长乐. 抗嘧啶水杨酸类除草剂油菜抗性遗传与分子机制研究. 镇江：江苏大学， 2023 [百度学术]

Liu C L. Genetic and molecular mechanism of new resistance mutation with pyrimidinyl carboxy herbicide in rapeseed. Zhenjiang： Jiangsu University， 2023 [百度学术]

Yoon T Y， Chung S M， Chang S I. Roles of Iysine 219 and 255 residues in tobacco acetolactate synthase. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2002， 293（1）： 433-439 [百度学术]

Garcia M D， Nouwens A， Lonhienne T G， Guddat L W. Comprehensive understanding of acetohydroxyacid synthase inhibition by different herbicide families. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2017， 114（7）： E1091-E1100 [百度学术]

王隆都. 闽中稻区除草剂应用现状与安全用药对策. 杂草科学， 2012， 30（3）： 64-66 [百度学术]

Wang L D. Application status of herbicide and safe drug use countermeasures in Minzhong rice area. Weed Science， 2012， 30（3）： 64-66 [百度学术]

Akira U， Ogata S， Kohara H， Yoshida S， Yoshioka， Watanabe H. Molecular basis of diverse responses to acetolactate synthase-inhibiting herbicides in sulfonylurea-resistant biotypes of Schoenoplectus juncoides. Weed Biology and Management， 2007， 7， 89 -96 [百度学术]

Christoffers M J， Nandula V K， Howatt K A， Wehking T R. Target-site resistance to acetolactate synthase inhibitors in wild mustard （Sinapis arvensis）. Weed Science， 2006， 54（2）： 191-197 [百度学术]

邓维. 抗苯磺隆播娘蒿抗性机理及抗性突变对乙酰乳酸合成酶功能影响. 北京：中国农业大学， 2017 [百度学术]

Deng W. The resistance mechanisms of tribenuron-methyl-resistant fixweed （Descurainia sophia L.） and effects of resistance-endowing mutantions on ALS functionality. Beijing： China Agricultural University， 2017 [百度学术]

郭月，卢鑫宇，王婷，李伟龙，祁余容，吕欣蕾，彭琦，高建芹，张洁夫，胡茂龙. 油菜抗除草剂新种质PN19的交互抗性鉴定及其抗性基因的表达研究. 中国油料作物学报， 2023， 45（6）： 1206-1216 [百度学术]

Guo Y， Lu X Y， Wang T， Li W L， Qi Y R， Lv X L， Peng Q， Gao J Q， Zhang J F， Hu M L. Cross-resistance of herbicide resistant novel germplasm PN19 in rapeseed and study on expression of resistance gene. Chinese Journal of Oil Crop Sciences， 2023， 45（6）： 1206-1216 [百度学术]

Hu D D， Jing J J， Snowdon R J， Annaliese S， Mason， Shen J L， Meng Y L， Zou J. Exploring the gene pool of Brassica napus by genomics-based approaches. Plant Biotechnology Journal， 2021， 19（9）： 1693-1712 [百度学术]

咸志慧，龙卫华，浦惠明，胡茂龙，高建芹. 抗除草剂油菜生态风险的研究进展. 中国油料作物学报， 2023，45（6）：1197-1205 [百度学术]

Xian Z H， Long W H， Pu H M， Hu M L， Gao J Q. Research progress on ecological risk of herbicide-resistant rapeseed. Chinese Journal of Oil Crop Scieneces， 2023， 45（6）： 1197-1205 [百度学术]

请使用 Firefox、Chrome、IE10、IE11、360极速模式、搜狗极速模式、QQ极速模式等浏览器，其他浏览器不建议使用!