番茄叶色基因<bold>Sllc1</bold>精细定位及候选基因分析

阮美颖; 柴亚倩; 周国治; 王荣青; 叶青静; 万红建; 姚祝平; 李志邈; 程远; RUAN Meiying; CHAI Yaqian; ZHOU Guozhi; WANG Rongqing; YE Qingjing; WAN Hongjian; YAO Zhuping; LI Zhimiao; CHENG Yuan

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1. 浙江省农业科学院蔬菜研究所，杭州 310021； 2. 石河子大学农学院，新疆石河子 832003

最近更新：2025-01-07

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240320004

目录contents

摘要

叶色突变体作为厘清植物叶绿素生物合成及叶绿体发育机制的重要工具，对于探究植物生长发育进程具有重要意义。本研究以绿色叶片番茄材料CR11A和浅黄色叶片番茄材料CH09-805为亲本，通过构建遗传群体明确叶色的遗传规律；对不同叶色植株开展叶片叶绿体超微结构观测及叶绿素含量测定，并进一步利用BSA-Seq及分子标记进行叶色基因定位，开展候选基因分析。研究结果表明，F₁植株叶片为绿色、F₂群体植株叶片出现12（绿色）∶3（浅黄色）∶1（金黄色）的分离比，说明番茄叶色性状受两对基因控制且存在显性上位效应；通过叶绿体超微结构观测及叶绿素含量测定，发现金黄色叶片叶绿体超微结构严重受损，其叶绿素含量显著低于浅黄色叶片与绿色叶片；利用BSA-Seq及分子标记将番茄叶色基因Sllc1定位于7号染色体114.53 kb的物理距离，候选区间内包括13个注释基因，结合基因注释信息及表达量鉴定，推测Solyc07g053630与Solyc07g053640为Sllc1的候选基因。本研究获得番茄叶色的候选基因，为番茄叶色形成分子机制解析奠定重要的材料基础及基因资源。

关键词

番茄; 叶色; BSA-Seq; 分子标记; 候选基因

叶片是植物光合作用的主要器官，直接影响光合效率，进而影响植物的生长发育与产量形成^［

1］。叶色突变主要是由控制叶绿体发育与光合色素等合成相关基因突变而导致，这些基因的变异将直接或间接影响光合色素的合成与降解^{［参考文献 2

百度学术}2］。叶色突变体可作为探讨叶绿体超微结构^{［参考文献 1

百度学术}1］、光合色素合成与降解等相关基因表达与调控的重要材料^{［参考文献 3-4}3-4］；也可用于杂交制种与种子纯度鉴定，降低生产成本^{［参考文献 5

百度学术}5］。

目前，园艺作物叶色突变研究已取得较多进展。Su等^［

6］利用BSA-Seq 和RNA-Seq克隆到4个调控生菜叶色的基因，其中bHLH转录因子突变导致花青素代谢途径被阻断而产生绿色叶片；其他3个基因（R2R3-MYB、R3-MYB、WD-40）突变会促进花青素积累，进而表现出不同的叶片色泽。Zhang等^{［参考文献 7

百度学术}7］利用正向遗传学克隆到控制莴苣叶色的基因LsGLK，发现其下游CACTA转座子插入导致可变剪切事件的发生，导致浅绿色莴苣的形成。黄瓜中存在一种叶色突变体SC311Y，与正常叶片相比，其叶片的叶绿体类囊体片层排列紊乱、数量少且层次不清，其内部有较多空小泡且无明显的淀粉粒；进一步定位到叶色突变基因Csa3G042730，推测出该基因可能通过调控叶绿体分裂相关蛋白影响叶绿体发育导致黄瓜黄色真叶形成^{［参考文献 8

百度学术}8］。通过大白菜突变体库筛选出一种高光合效率、叶绿素积累及叶色更深的突变体，遗传分析发现该叶色深绿突变性状由单基因控制；结合MutMap明确该叶色突变基因为BrFC2，其保守结构域发生单碱基突变（dBrFC2），过表达该突变基因则出现叶色深绿表型且血红素和叶绿素含量同时提高^{［参考文献 9

百度学术}9］。Liu等^{［参考文献 10

百度学术}10］通过对辣椒光敏感突变体yl1及其野生型6421在不同光照条件下的表型和生化分析，发现光照强度可影响类胡萝卜素生物合成，bHLH71-like转录因子在辣椒叶片黄化过程中发挥正向调控作用。园艺作物叶色突变研究可为深入解析叶色突变分子机制奠定理论基础，为园艺作物的遗传改良与品种选育提供新的策略。

作为园艺作物研究的模式植物，番茄（Solanum lycopersicum）在世界范围内广泛栽培。目前，关于番茄色泽的研究集中于果实、叶脉及叶片。Liu等^［

11］研究发现番茄中调控叶绿素合成和叶绿体发育的关键基因SlRCM1，该基因编码的蛋白质Lutescent1对番茄果实的叶绿素合成和叶绿体发育起着重要作用。Lu等^{［参考文献 12

百度学术}12］综合运用全基因组关联分析和基因定位，锁定一个调控叶脉明暗的主要候选基因Solyc05g054030，采用CRISPR/Cas9技术及过表达验证该基因是在番茄叶脉中特异性表达且调控叶脉明暗的关键基因。关于番茄叶色的研究，有研究表明叶绿体结构受损、色素含量降低及低水平的活性氧清除能力是导致番茄叶片黄化突变的主要因素^{［参考文献 1

百度学术}1］；Song等^{［参考文献 13

百度学术}13］鉴定到一个类囊体及光合作用表现缺陷的番茄斑叶突变体，经基因定位、表达量分析及CRISPR/Cas9技术确定vg基因的下调表达是导致番茄杂色叶表型出现的原因，vg在番茄叶绿体发育、叶绿素合成及光合作用中发挥重要作用。

本研究以绿色叶片及浅黄色叶片番茄为试验材料，通过构建遗传群体明确叶色基因的遗传规律；利用叶绿体超微结构观测及叶绿素含量分析明确番茄叶片颜色变异的生理生化机制；利用BSA-Seq及开发的分子标记定位番茄叶色基因，结合基因组注释信息及候选基因变异分析，明确Sllc1的候选基因。研究结果为后续基因功能验证及其分子机制解析奠定重要基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

分别以绿色叶片番茄材料CR11A为母本（P₁）、浅黄叶片番茄材料CH09-805为父本（P₂）构建F₁及F₂群体。将双亲及F₁与F₂群体于2022年春季种植于浙江省农业科学院杨渡科研创新基地，其中，F₂群体为415株，株距为40 cm，行距为50 cm，每畦两行种植，采用常规管理方法进行田间管理。

1.2 番茄幼苗叶片叶绿素含量测定

于植株四叶一心期随机取双亲、F₁及F₂群体（绿色、浅黄色、金黄色）各3株，选取自上而下第3、4片叶片（去除叶脉），称量约1.0 g于液氮中研磨至匀浆；利用10 mL无水乙醇抽提样品，样品变白后过滤，最终用无水乙醇定容至30 mL；以无水乙醇为空白对照，使用分光光度计在649 nm和655 nm下测定吸光值。

叶绿素a = 0.03×（13.7D₆₆₅- 5.76D₆₄₉）

叶绿素b = 0.03×（25.8D₆₄₉-7.6D₆₆₅）

总叶绿素 = 0.03×（叶绿素a+叶绿素b）

其中，叶绿素a表示叶绿素a的含量；叶绿素b表示叶绿素b的含量；总叶绿素表示总叶绿素的含量。利用Microsoft Excel 2003进行数据整理，采用R 4.3.1进行数据分析，利用Origin 2023绘图。

1.3 番茄幼苗叶片叶绿体超微结构观测

各取3株四叶一心期F₂群体的绿色、浅黄色及金黄色叶片（自上而下第3、4片叶片），用2.5%（v/v）戊二醛溶液固定，0.1mol/L PBS缓冲液冲洗；1.0%（v/v）四氧化锇固定，再次用PBS缓冲液（0.1 mol/L）冲洗；最后乙醇分级脱水，Spurr试剂盒（Electron Microscopy Sciences，USA）进行包埋，70℃环氧树脂聚合。利用Leica UC6超微切片机（Leica， Wetzlar， Germany）切片，室温下，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，最后在H7650显微镜（HITACHI， Tokyo， Japan）下观察叶绿体超微结构。

1.4 番茄叶片颜色性状调查与统计

植株四片真叶期，对亲本及F₂群体中单株的叶色进行表型数据统计和拍照，经卡方检验，分析F₂群体中的叶片颜色分离比。

1.5 集团分离分析法（BSA， bulked segregant analysis）混池构建与测序

采用CTAB法从亲本及F₂植株的叶片中提取基因组DNA^［

14］。从F₂群体中每个表型各取30株构建3个DNA混池，即绿色叶片池（F₂-N）、浅黄色叶片池（F₂-Y）和金黄色叶片池（F₂-G）。取每个样本至少1 μg基因组DNA用于Illumina测序的文库构建。根据说明使用Illumina TruSeq Nano DNA样品试剂盒（Illumina， San Diego， USA）构建大小约为450 bp DNA片段插入双末端测序文库。利用TBS380（Invitrogen， CA， USA）检测DNA质量，库的测序工作由南京集思慧远生物科技有限公司完成，使用Illumina Novaseq 6000平台进行双端150 bp的测序。

利用Trimmomatic默认参数对原始配对末端读数进行处理和质量控制^［

15］。使用BWA软件将高质量的测序读数与番茄参考基因组进行比对^{［参考文献 16

百度学术}16］。通过Picard工具去除PCR重复读数后，使用自定义Perl脚本计算测序深度和覆盖率。利用GATK软件对有效的BAM文件进行SNPs和InDels检测^{［参考文献 17

百度学术}17］。随后，通过质量过滤生成变式调用格式（VCF）文件，使用VCFtools对VCF文件进行过滤^{［参考文献 18

百度学术}18］。利用ANNOVAR对检测到的变异（SNP和InDels）进行注释^{［参考文献 19

百度学术}19］。去除小于0.3或大于0.7的两个批量中的 SNP-index和InDel-index后，使用自定义perl脚本计算ΔSNP-index和ΔInDel-index，并使用R脚本绘制曼哈顿图。使用10 kb滑动窗口，以超过1 Mb为间隔计算SNP-index和InDel-index。

1.6 候选基因的精细定位

1.6.1 SSR引物合成和PCR程序

为进一步缩小定位区间，在初定位区域内开发新的SSR分子标记（表1）。这些SSR分子标记首先在两个亲本池、F₂-N、F₂-Y和F₂-G之间进行筛选，选择具有多态性且呈现共分离的引物，然后对F₂群体的浅绿植株及金黄植株进行重组单株筛选。12 μL的PCR反应体系如下：2 μL模板DNA（50 ng/μL）、6 μL Taq 2× PCR Master （浙江易禾基因科技有限公司）、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、加灭菌ddH₂O至12 μL。PCR扩增程序：预变性94℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃延伸10 min。

表 1 用于定位目的基因的29对SSR引物

Table 1 29 pairs of SSR primers used to map target gene

引物名称 Primer name	位置（bp） Position	正向引物（5′-3′） Forward primer （5′-3′）	反向引物（5′-3′） Reverse primer （5′-3′）
SSR-1	60456724	TCAAACGGTTTAGGTCGTCA	AAAAACGCTGTGAACTGGCT
SSR-168	60747214	TCATTGTGTTGTTCAAATGTCG	CCCAACTTTTACTCGGTCCA
SSR-193	60777491	AGAAGTGCACATGGAGTTGC	TCAAATTGACTTTCGAAAAATG
SSR-209	60805234	CAAATGCGTATGATCCAAGG	GGGGCATATTTGACCCTTTT
SSR-250	60873273	TGTTGTTTTTGCTTGCAAGATT	TAGATGTTGAACCCCTTCGC
SSR-313	60977651	GGGGGTTCAATTACCCAAGT	TCCATGCTGGTTGCAAATAA
SSR-365	61048131	TGGAATATTTATGTAAAGAAGCCCT	TTTTTCGACGATAGAAATCGC
SSR-431	61267542	ATTTTGGCCAATGTTCATCC	TGCAACGAAGATCCAGTTGA
SSR-502	61902146	GGTTGAGAAGCAGAGGATGC	GCAGGAACACCAACTCCATT
SSR-504	61914340	GGGTATGTCTGTCTTCAGTGCTT	GCATCCATGTGTCCAAAAGA
SSR-506	61916579	TGATTGTTGGATGATTTTTGTTG	GAATTTGTGTCACCTTAGCTTTGA
SSR-511	61923026	GCTAGTTTCGGAGGAGTGGTT	TTTGGGCCATATTTTAAATTCC
SSR-515	61926643	AAGGTGGTCTGGACCATGAA	TGAAAATTGCAGGTCAATGAG
SSR-516	61926693	AAGGTGGTCTGGACCATGAA	TGAAAATTGCAGGTCAATGAG
SSR-518	61942450	CGGCACATTTCATCCAACTA	TTCTCTCTTTTTGGCCGCTA
SSR-519	61947945	TTGGGTATTCTTCCGCTGTT	CCCTGAGCTAGTGGGAACTG
SSR-524	61961804	TGGCATTGGACCTCTATTCC	GCACAGAAATTTCAGCAGCA
SSR-527	61988034	TCGTTCATTGTATGCTTGCC	TAAATGAAGCCATCACGCAA
SSR-530	62001178	AAATGCTTTTTGAAAATTGAACAC	TCATGGTGATTTTGCAATCC
SSR-532	62001486	GGATTGCAAAATCACCATGA	CAAGAATGCTTTTGAAATTTAAGG
SSR-538	62019471	TCTCCGAAAAATACAACCACAA	TCTCGGAGAAATCATTGTTGC
SSR-547	62076329	TGCCATGTTCTTCCTTAGCA	AAAAAGCACATCGGCAAACT
SSR-553	62093075	CTTGATCTTAACCTTGCGCC	ACGAGAAAGTTTCAGCTGCC
SSR-554	62104577	CAACTGCACGGAATTGTACG	AAGATTTCTGGGTCGGGTCT
SSR-555	62104666	CAACTGCACGGAATTGTACG	AAGATTTCTGGGTCGGGTCT
SSR-557	62104795	AGACCCGACCCAGAAATCTT	AGCTGCTGCTACTGCACCAT
SSR-571	62151829	GCTATGAAAGGGACATAGCTGC	AAAAGGTGAGCGTTTCCAGA
SSR-602	63835056	ACCAATTGGCACTTGTTCCT	GGGGAAGGGGTGAATTGTAG
SSR-603	63836393	TTTAAACTGCCAAAGGCCAC	TTGGTTCATCTTTCACTCGCT

1.6.2 非变性聚丙烯凝胶电泳

PCR扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶检测，电泳缓冲液为0.5×TBE，恒定电压300 V，电泳3 h，电泳结束后，先用去离子水清洗一遍凝胶，再用硝酸银溶液染色12 min，去离子水清洗一遍，然后加入氢氧化钠-甲醛溶液显色5 min，去离子水清洗一遍，最后使用保鲜膜包胶，拍照记录，统计条带。所用引物均由北京擎科生物科技有限公司（杭州分公司）合成。

1.6.3 荧光定量PCR（qRT-PCR）

利用Primer6设计候选基因的qRT-PCR特异性引物（表2），由北京擎科生物科技有限公司（杭州分公司）合成。PCR产物长度为150~300 bp，提取植株双亲及F₂各表型叶片的总RNA（天根植物RNA提取试剂盒）并反转录（天根反转录试剂盒）得到cDNA后利用南京诺唯赞AceQ qPCR SYBR Green Master Mix （High ROX Premixed）试剂盒与StepOne实时荧光定量PCR系统（ABI， Foster City，CA，USA）进行qRT-PCR，20 μL反应体系如下：2×ChamQ Universal SYBR qRCR Master Mix为10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA为1 μL，加灭菌ddH₂O至20 μL。qRT-PCR扩增程序：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性5 s，58 ℃退火25 s；72 ℃延伸18 s，50个循环；72 ℃ 10 min。各基因设置3个生物学重复，相对定量的最终值与内参基因Actin对照相比^［

20］，测试样本中基因表达的倍数变化，采用2^-ΔΔCT法分析候选基因的相对表达量。

表2 qRT-PCR特异性引物序列

Table 2 qRT-PCR specific primer sequence

基因ID

Gene ID

正向引物（5′-3′）

Forward primer （5′-3′）

反向引物（5′-3′）

Reverse primer（5′-3′）

Solyc07g053630

GCATACCACCCGTATCGTCG

GGACATACAGGATGAAAGTCGC

Solyc07g053640

ATTGAAGCACCAGCACCACT

TGTAGGACTCGTCCGTGTTG

Solyc02g064700（Actin）

TTGGGAAGGTTCTGGGGACT

ATGGTTTCCTGCTGTGTCGT

2 结果与分析

2.1 幼苗叶片叶绿体超微结构观测

母本与父本的叶片颜色分别是绿色与浅黄色，F₁的叶片颜色为绿色，F₂群体中出现3种叶片颜色：绿色、浅黄色与金黄色（图1A）。对F₂群体中的绿色、浅黄色及金黄色叶片进行叶绿体超微结构观察（图1B），发现绿色叶片叶绿体在细胞中最稳定，其叶绿体数量较多、基粒结构清晰且排列紧密；浅黄色叶片次之；金黄色叶片叶绿体体积缩小、片层结构模糊不清、其超微结构严重受损。

图1 F₂群体中不同叶色的表型（A）与叶绿体超微结构（B）

Fig. 1 Phenotypes（A） and chloroplast ultrastructure（B） of different leaf colors in F₂ population

F₁是由CR11A与CH09-805杂交得到；F₂-N、F₂-Y、F₂-G分别代表F₂群体的绿色、浅黄色及金黄色植株；图B中，红色框内的结构为叶绿体； Chl：叶绿体；PM：质膜；CW：细胞壁；SP：淀粉粒；LST：基粒片层；OS：嗜饿颗粒；下同

F₁ is a cross between CR11A and CH09-805； F₂-N， F₂-Y and F₂-G were green， light yellow and golden yellow plants obtained from F₂； The structure in the red box is chloroplast in figure B； Chl： Chloroplast； PM： Plasma membrane； CW： Cell wall； SP： Starch granules； LST： Grain-based lamella； OS： Hungry granule； The same as below

2.2 幼苗叶片叶绿素含量分析

通过测定双亲、F₁及F₂群体中绿色、浅黄色、金黄色叶片的叶绿素含量，发现母本CR11A叶片的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量分别为0.924 mg/g、0.251 mg/g、1.175 mg/g；父本CH09-805叶片的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量分别为0.787 mg/g、0.186 mg/g、1.058 mg/g；母本叶片的各叶绿素含量分别比父本高17.41%、34.95%和20.76%。F₂-N叶片的叶绿素a含量分别比F₂-Y与F₂-G高35.52%、516.15%；F₂-N叶片的叶绿素b含量分别比F₂-Y与F₂-G高81.53%、1483.33%；F₂-N叶片的总叶绿素含量分别比F₂-Y与F₂-G高43.92%、613.97%。F₂群体中不同颜色叶片的各叶绿素含量均差异显著，且F₂-N叶片的各叶绿素含量均与母本及F₁叶片的各叶绿素含量差异不显著（图2）。

图 2 双亲及F₁与F₂群体中不同叶色叶片的叶绿素含量分析

Fig. 2 Chlorophyll content analysis of leaves in both parents and F₁ and F₂ populations with different leaf color

P₁表示母本；P₂表示父本；不同字母表示差异显著（P <0.05）；下同

P₁ represents the mother； P₂ is the father； Different letters indicated significant difference（P <0.05）； The same as below

2.3 番茄幼苗叶片颜色遗传规律分析

对番茄幼苗叶片颜色表型调查发现，F₁植株表现为正常绿色，F₂群体中出现3种叶片颜色表型，有289株绿色叶片植株，100株浅黄色叶片植株，26株金黄色叶片植株，符合12∶3∶1的孟德尔遗传比例（χ² = 7.92 <χ²_0.01= 9.21）（表3）。表明番茄叶色性状受两对基因控制且存在显性上位效应，将两对基因分别命名为Leaf color 1（Sllc1）和Leaf color 2（Sllc2）。

表3 番茄叶片颜色性状的遗传分析

Table 3 Genetic analysis of tomato leaf color trait

群体 Population	总株数 Total individuals	绿叶株数 Individuals of green leaf	浅黄叶株数 Individuals of yellow leaf	金黄叶株数 Individuals of gold leaf	预期比例 Expected ratio	χ²
P₁（CR11A）	30	30	0	0	-	-
P₂（CH09-805）	30	0	30	0	-	-
F₁	30	30	0	0	-	-
F₂	415	289	100	26	12∶3∶1	7.92

-：无数据；下同

-：No data；The same as below

2.4 测序质量评估与分析

对双亲进行测序，父母本Clean reads总数分别为76717111和80366369；总碱基数分别为23015133300 bp和24109910700 bp，平均测序深度分别为27.40×和30.06×，基因组比对率≥93.31%（表4）。

表4 BSA-Seq 测序结果

Table 4 Results of BSA-Seq

样本 Samples	Clean reads总数 Total number of clean reads	总碱基数（bp） Total base number	基因组比对比率（%） Genome comparison ratio	平均测序深度（×） Average sequencing depth
P₁（CR11A）	76717111	23015133300	96.63	27.40
P₂（CH09-805）	80366369	24109910700	93.31	30.06
F₂-N	113292703	33987810900	97.81	42.51
F₂-Y	114339444	34301833200	97.73	42.59
F₂-G	42841416	12852424800	88.64	16.08

对F₂-N、F₂-Y与F₂-G进行BSA-Seq测序，Clean reads总数在42841416~114339444；各混池总碱基数为12852424800~34301833200 bp，平均测序深度为16.08×~42.59×，基因组比对率≥88.64%（表4）。说明所有样本测序质量合格，数据比对率高，有利于后续的变异检验及性状的基因定位。

2.5 SNP检测与注释

根据测序结果进行SNP位点分析，5个样本中，F₂-N中SNP位点最少，为4309569个，亲本P₂（CH09-805）中最多，为4716390个。5个样本之间，同一类型的SNP数量和比例大致相当。所有SNP变异中，已确定的位置信息包括15种类型，其中，以位于基因区间的SNP位点最多，同义终止密码子突变类型的SNP最少（表5）。

表5 变异位点注释统计

Table 5 Statistical of annotation of variation sites

序号 No.	变异位点信息 Variation site information	P₁（CR11A）	P₂（CH09-805）	F₂-N	F₂-Y	F₂-G
1	基因区间	3432243	3370798	3140542	3312463	3347080
2	基因上游区域（5 kb以内）	566535	673378	580352	624630	631286
3	基因下游区域（5 kb以内）	351287	395065	346526	370911	374632
4	剪切受体突变	274	298	276	285	282
5	剪切供体突变	249	269	242	251	261
6	内含子	139816	162224	143664	153315	153869
7	非同义编码突变	39287	45912	39889	42278	42619
8	同义编码突变	24786	31571	26750	28140	28422
9	同义终止密码子突变	87	109	91	99	100
10	起始密码子丢失	208	235	209	220	223
11	起始密码子获得	519	684	596	625	652
12	终止密码子丢失	344	376	341	356	355
13	终止密码子获得	1278	1326	1156	1283	1276
14	5′非翻译区	9977	13357	11282	12122	12318
15	3′非翻译区	14958	20214	17152	17885	18358
16	其他	478	574	501	510	513
17	SNP总数	4582326	4716390	4309569	4565373	4612246

2.6 BSA-Seq及开发的分子标记对番茄叶色基因Sllc1精细定位

利用F₂群体进行BSA-Seq测序，分析F₂群体3个混池的Δ（SNP-index）值分布，对控制番茄叶色性状的基因进行定位。通过对F₂-N和F₂-Y进行分析，将番茄叶色基因定位于7号染色体60450305~63932942 bp之间，物理距离为3.48 Mb；通过对F₂-N和F₂-G进行分析，将番茄叶色基因定位于4号染色体2434439~2665624 bp及7号染色体60850272~63026879 bp之间，物理距离分别为0.23 Mb和2.18 Mb（图3A）。共同将番茄叶色基因定位在7号染色体60850272~63026879 bp之间，物理距离为2.18 Mb，本研究对该定位区域进行进一步分析。

图3 利用BSA-Seq及分子标记多态性筛选对Sllc1精细定位

Fig. 3 Fine-mapping of Sllc1 using BSA-Seq and molecular maker polymorphism screening

A：Sllc基因座的BSA-seq图谱；B，C： Sllc基因座连锁图谱与精细定位；绿色分子标记表示在该区间内可能存在Sllc基因

A： BSA-seq mapping of the Sllc locus；B，C： Linkage mapping of the Sllc locus and fine-mapping； The green molecular marker indicates that the Sllc gene may be present in this region

以亲本、F₁、F₂（绿色、浅黄色、金黄色）叶片的DNA为模板，选取初定位区域进行SSR分子标记多态性筛选，获得29对扩增效果好且呈现共分离的SSR分子标记（表1）。经重组单株的统计分析，将叶色基因定位于7号染色体SSR-502~SSR-571（61902146~62151829 bp），物理距离为249.68 kb的候选区间内（图3B）；进一步进行SSR筛选，获得16对共分离SSR分子标记（表1），对重组单株统计分析发现，番茄叶色候选区间缩小至SSR-524与SSR-547之间，标记位置为分别61961804 bp和62076329 bp，区间大小为114.53 kb（图3C）。

2.7 候选基因分析

番茄基因组注释及全基因组测序数据表明114.53 kb的候选区间内共有13个基因，包括Solyc07g053610 （编码含homeobox-DDT结构域的蛋白）、Solyc07g053620（编码类DnaJ蛋白）、Solyc07g053630（编码类Golden1蛋白）、Solyc07g053640（编码含GATA锌指结构域的类蛋白14）、Solyc07g053650（编码26S蛋白酶非ATP酶调节亚基2同源体A）、Solyc07g053660（编码DDB1和CUL4相关因子13 DDB1-and CUL4-associated factor 13）、Solyc07g053670（编码蛋白质核融合缺陷6，类叶绿体/线粒体异构体）、Solyc07g053680（编码含NAC结构域的类蛋白78）、Solyc07g053690（编码未特征化蛋白At4g28440）、Solyc07g053700（编码网状体样蛋白B17）、Solyc07g053710（编码类酪氨酸氨基转移酶）、Solyc07g053720（编码类S-烷基硫代羟胺裂解酶）及Solyc07g053730（编码类核仁GTP结合蛋白）（表6）。

表6 候选区间内基因的变异信息

Table 6 Variation information of genes in the candidate interval

基因 ID Gene ID	位置（bp） Position	影响 Effects	编码改变 Code-change	注释 Annotation
Solyc07g053610	61961804	内含子	EXON_ID=2	编码含homeobox-DDT结构域的蛋白
Solyc07g053610	61963709	内含子	EXON_ID=2	编码含homeobox-DDT结构域的蛋白
Solyc07g053620	-	上游	-	编码类DnaJ蛋白
Solyc07g053630	61989906	内含子	EXON_ID=5	编码类Golden1蛋白
Solyc07g053630	61990098	同义密码子编码	taC/taT	编码类Golden1蛋白
Solyc07g053640	62019388	非同义密码子编码	Gtt/Ttt	编码含GATA锌指结构域的类蛋白14
Solyc07g053640	62019396	同义密码子编码	tcC/tcT	编码含GATA锌指结构域的类蛋白14
Solyc07g053640	62019487	非同义密码子编码	Gac/Aac	编码含GATA锌指结构域的类蛋白14
Solyc07g053650	62028142	内含子	EXON_ID=11	编码26S蛋白酶非ATP酶调节亚基2同源体A
Solyc07g053660	62040708	3'非翻译区	-	编码DDB1和CUL4相关因子13
Solyc07g053670	-	-	-	编码蛋白质核融合缺陷6，类叶绿体/线粒体异构体
Solyc07g053680	-	上游	-	编码含NAC结构域的类蛋白78
Solyc07g053690	-	上游	-	编码未特征化蛋白At4g28440
Solyc07g053700	62059249	同义密码子编码	ctC/ctT	编码网状体样蛋白B17
Solyc07g053700	62059258	同义密码子编码	gcT/gcC	编码网状体样蛋白B17
Solyc07g053700	62059262	非同义密码子编码	aTt/aCt	编码网状体样蛋白B17
Solyc07g053710	62062266	非同义密码子编码	Ttt/Att	编码类酪氨酸氨基转移酶
Solyc07g053710	62063462	同义密码子编码	ttG/ttA	编码类酪氨酸氨基转移酶
Solyc07g053710	62064520	非同义密码子编码	Aaa/Gaa	编码类酪氨酸氨基转移酶
Solyc07g053720	62069951	非同义密码子编码	cTg/cGg	编码类S-烷基硫代羟胺裂解酶
Solyc07g053730	-	上游	-	编码类核仁GTP结合蛋白
Solyc07g053730	-	下游	-	编码类核仁GTP结合蛋白

候选区间内，Solyc07g053640、Solyc07g053700、Solyc07g053710、Solyc07g053720发生非同义突变；Solyc07g053630、Solyc07g053640、Solyc07g053700及Solyc07g053710发生同义突变；变异发生在内含子区域的基因有：Solyc07g053610、Solyc07g053630及Solyc07g053650；变异发生在基因上下游的基因有：Solyc07g053620、Solyc07g053680、Solyc07g053690及Solyc07g053730；此外，Solyc07g053660的变异发生在3'非翻译区（表6）。结合基因注释信息及基因变异信息，预测Solyc07g053630和Solyc07g053640为Sllc1的候选基因。

2.8 候选基因表达量分析

通过检测Solyc07g053630和Solyc07g053640在双亲及F₂不同叶色植株中的表达量，发现Solyc07g053630和Solyc07g053640在P₁与F₂的绿叶中的表达量均显著高于P₂及F₂的黄色与金黄色叶片，2个基因在F₂的金黄色叶片中的表达量也显著低于P₂与F₂的浅黄色叶片。表明Solyc07g053630和Solyc07g053640均可能参与调控番茄叶片叶绿素合成或叶绿体发育过程。

图 4 Solyc07g053630和Solyc07g053640在双亲与F₂群体叶片中的相对表达量鉴定

Fig. 4 Identification of Solyc07g053630 and Solyc07g053640 relative expression levels in leaves of both parents and F₂ population

3 讨论

叶片是作物进行光合作用的重要组织器官，为植物生长发育提供营养基础与能量保障。叶片颜色等性状与作物光合作用效率直接相关，进而影响作物产量形成^［

21］。叶绿体是植物光合作用的主要场所^{［参考文献 22

百度学术}22］，其结构、数量及叶绿素含量均与叶片颜色相关^{［参考文献 23

百度学术}23］。研究发现，叶片黄化导致甜瓜叶绿体发育异常，使其光合色素含量及比例均发生变化^{［参考文献 24

百度学术}24］。本研究对F₂不同颜色的叶片进行细胞学观测与叶绿素含量测定，发现金黄色叶片的叶绿体超微结构严重受损，而绿色叶片中叶绿体数量最多、基粒结构清晰且排列紧密；此外，金黄色叶片叶绿素含量也显著低于绿色叶片。据此看出，番茄黄化突变体形成可能是其叶绿体数目及其基粒片层结构等发育异常，进而使叶绿素合成受阻所致^{［参考文献 5

百度学术}5］。

近年来，植物叶色性状的遗传模式受到大量研究者的广泛关注。叶色突变相关基因纷繁复杂，可能与细胞核基因有关，也可能与细胞质基因有关，其突变体有单基因控制的，也有多基因控制的，控制叶色突变体材料不同，遗传模式也存在差异^［

5］。诸多研究提出控制番茄叶色突变的基因属于单基因隐性遗传^{［参考文献 25-27}25-27］。但本研究采用绿色叶片番茄材料CR11A为母本，浅黄色叶片番茄材料CH09-805为父本，构建F₁及F₂群体。F₂群体叶片颜色符合12∶3∶1的孟德尔遗传比例，初步证明番茄叶色遗传符合两个基因的显性上位互作模型。

GLK转录因子是植物中的一类重要调控蛋白，在叶绿体发育及叶绿素合成中起重要作用。GLK转录因子直接参与调控与光合作用相关基因的表达，缺乏或功能失活的GLK基因会导致叶绿体发育受损，叶绿素含量减少，光合作用效率下降，从而影响植物的生长发育^［

27］。目前已在拟南芥^{［参考文献 28

百度学术}28］、水稻^{［参考文献 29

百度学术}29］、小麦^{［参考文献 30

百度学术}30］及白桦树^{［参考文献 31

百度学术}31］等植物中发现GLK参与作物叶绿体发育及叶绿素合成过程。本研究番茄叶色基因定位候选区间内也存在1个GLK基因：Solyc07g053630，该基因编码类Golden1蛋白，变异发生在内含子区域（EXON_ID=5）。该变异可能通过影响mRNA的加工、稳定性和运输等多个层面间接影响类Golden1蛋白的合成、结构和功能。

锌指在植物各组织的叶绿素代谢和叶绿体形态建成中扮演重要角色^［

32］。研究发现番茄OBV基因的突变会引起叶脉变暗，该基因负责编码含C₂H₂锌指结构域的转录因子，在调控叶绿体的发育及光合作用过程中起着至关重要的作用^{［参考文献 12

百度学术}12］。通过对黄瓜绿色叶片与黄色叶片进行RNA-Seq分析发现，大多GATA（锌指同源结构域转录因子家族）在绿色叶片中上调表达，其中8个GATA基因在绿叶与黄叶间差异表达，推测它们与黄瓜叶片叶绿素合成有关^{［参考文献 33

百度学术}33］。此外，在辣椒^{［参考文献 34

百度学术}34］、拟南芥^{［参考文献 35

百度学术}35］及西瓜^{［参考文献 36

百度学术}36］等作物上也发现锌指参与调控植物叶绿素合成及叶绿体发育等生理过程。本研究中，Solyc07g053640即为编码含GATA锌指结构域的类蛋白14的基因，可发生非同义突变（Gac/Aac）。

结合定位区间内基因组注释信息、表达量鉴定及相关文献报道，进一步将Solyc07g053630与Solyc07g053640预测为番茄叶色突变的候选基因，但后续仍需通过基因功能验证进一步确定其功能与调控机制。

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