山西谷子萌发期耐盐性鉴定及相关性状<bold>GWAS</bold>分析

秦慧彬; 任觐; 娄坤; 商春悦; 阳世杰; 侯森; 李萌; 王海岗; 穆志新; QIN Huibin; REN Jin; LOU Kun; SHANG Chunyue; YANG Shijie; HOU Sen; LI Meng; WANG Haigang; MU Zhixin

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山西谷子萌发期耐盐性鉴定及相关性状GWAS分析 PDF

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1. 山西农业大学农业基因资源研究中心/农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，太原 030031； 2. 山西农业大学农学院，太谷030801

最近更新：2025-01-07

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240407002

目录contents

摘要

为研究山西谷子萌发期耐盐性、筛选与谷子耐盐性相关的候选基因，及了解谷子种子在盐胁迫下萌发相关性状的遗传机制，本试验共抽取333份山西核心种质，在光照培养室采用170 mmol/L NaCl溶液胁迫，对萌发期谷子进行耐盐性鉴定。采用隶属函值法对谷子耐盐等级进行分类，以相对发芽势、相对发芽率、相对根长、相对芽长、相对发芽指数5个相关性状的综合评价D值对谷子萌发期耐盐性进行评价。结合核心种质重测序结果，开展耐盐性全基因组在萌发期的关联分析。结果表明，供试谷子核心种质耐盐性差异显著，利用综合评价D值，把333份谷子核心种质的耐盐性划分为5类，其中高耐盐种质有17份。全基因组关联分析共检测到84个与萌发期耐盐性相关的SNP位点，对显著关联SNPs所在基因进行功能注释，分析筛选到与萌发期相关的耐盐候选基因Millet_GLEAN_10019153，并对该基因进行了单倍型分析。本研究结果对耐盐谷子种质的鉴选及耐盐基因挖掘具有一定参考意义。

关键词

谷子; 核心种质; 萌发期; 耐盐性; GWAS

土壤盐碱化是影响全球作物生长、发育和生产力的主要非生物胁迫^［

1］。盐胁迫对植物的各种表型性状、生理机能和生化指标均有不良影响，尤其是在繁殖期，如种子萌发和幼苗生长等阶段^{［参考文献 2-3}2-3］。谷子（Setaria italica （L.） P. Beauv.）作为最古老的驯化作物之一，是典型的环境友好型作物，具有抗旱、耐盐、水分利用率高、适应性广、耐恶劣土壤条件、产量稳定性强等特性^{［参考文献 4

百度学术}4］。筛选耐盐性好的谷子品种，可为开发适合盐碱地栽培的耐盐种质资源、选育耐盐品种、改良盐碱地和促进农业可持续发展奠定基础^{［参考文献 5

百度学术}5］。谷子相较于玉米、高粱等C4作物具有简明的基因组（约420 Mb）、较短的生长周期、适合室内培养和易于遗传转化等特点，因而成为全球关注的可耐逆作物研究对象和禾本科C4作物新模式植物，是挖掘耐盐相关基因的理想作物^{［参考文献 6

百度学术}6］。

耐盐性是一个复杂的数量性状，单一性状的测定并不能很好地反映植物的耐盐性。评价植物耐盐性的方法有很多，其中隶属函数法是最常用鉴定方法，即基于权重计算隶属函数值和D值^［

7］。隶属函数分析可以整合更多的性状，以筛选和评价不同植物品种的耐盐种质。谷子萌发期以发芽势、发芽率、芽长和根长在盐胁迫与对照条件下的相对值能较好区分不同种质耐盐性差异^{［参考文献 8-9}8-9］。甜高粱萌发期耐盐研究采用发芽势、发芽率、发芽指数、发芽活力指数、根鲜重在盐胁迫与对照条件下的相对值作为综合指标对高粱种质进行了耐盐性评价和筛选^{［参考文献 10

百度学术}10］。

全基因组关联分析（GWAS， genome-wide association study）是在群体水平上和基因组层面上对遗传性状进行解析，是通过表型变异与全基因组遗传标记之间的关联分析，来识别与特定性状相关的遗传位点^［

11］。GWAS已经在玉米^{［参考文献 12

百度学术}12］、谷子^{［参考文献 13

百度学术}13］、高粱^{［参考文献 14

百度学术}14］、水稻^{［参考文献 15

百度学术}15］、棉花^{［参考文献 16

百度学术}16］等多种作物上进行了验证和实施，为分子辅助育种做出了积极的贡献。在谷子的GWAS研究方面，Li等^{［参考文献 17

百度学术}17］通过全基因组关联分析对300份谷子种质资源的吸水能力进行了研究，并鉴定出两个与饱和吸水相关的候选基因Si4g02810和Si4g02840。Jaiswal等^{［参考文献 18

百度学术}18］对104份谷子材料11种营养物质进行多环境表型评价，并与基因型数据进行GWAS分析，得到67个高置信度标记位点。Zuo等^{［参考文献 19

百度学术}19］通过GWAS分析确定了谷子籽粒中与黄色素相关的基因组区域，确认SiPSY1基因是谷子籽粒中黄色素积累的主要基因。然而，利用GWAS来鉴定谷子耐盐性相关的QTL尚未见报道。

本研究对333份山西核心谷子种质资源进行了耐盐性综合评价，确定了以相对发芽势、相对发芽率、相对根长、相对芽长、相对发芽指数作为关键评价指标对萌发期谷子进行耐盐性鉴定评价。将这5个关键评价指标与谷子重测序基因组进行全基因组关联分析，为挖掘谷子耐盐基因提供价值指导、为选育盐碱地谷子品种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料由国家特色杂粮作物种质资源中期库（太原）提供，来源于山西不同地区的333份谷子核心地方品种（详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr. 20240407002，附表1），能够较好地代表山西谷子地方品种的遗传变异，涵盖了山西谷子地方品种的基本遗传多样性^［

20］。所用材料为试验当年（2022年）种植，每份材料播种1行，行长5 m，行距30 cm，株距10 cm。苗高 10 cm时进行间苗，每行留苗50株，常规田间管理。收获后干燥，于4℃低温库保存。

表1 与谷子耐盐相关性状显著相关的遗传位点（SNPs）分布

Table1 Distribution of genetic loci （SNPs） significantly associated with salt tolerance related traits in foxtail millet

性状 Traits	染色体 Chromosome	SNP数目 SNP number	显著SNP位置（bp） Peak SNP position	位置 Region	-log₁₀（P）
相对发芽势 RGP	Chr.1	1	33820086	Downstream	5.34
	Chr.3	1	6186397	Intergenic	5.08
	Chr.4	1	19582794	Intergenic	5.04
	Chr.7	1	16687788	Splicing	5.47
	Chr.9	1	17264701	Intronic	5.15
相对发芽率 RGR	Chr.1	2	33820086	Downstream	5.17
	Chr.3	1	32161954	Intergenic	5.52
	Chr.5	1	34363071	Exonic	5.11
	Chr.7	1	31110581	Intergenic	5.44
	Chr.8	3	39730408	Intergenic	5.05
	Chr.9	1	32409782	Downstream	5.18
相对根长 RRL	Chr.1	1	11531491	Intergenic	5.10
	Chr.2	3	17455495	Intergenic	5.15
相对根长 RRL	Chr.3	1	36730502	Intergenic	5.23
	Chr.6	36	3304736	Intergenic	5.01
	Chr.8	1	13407866	Intronic	5.28
相对芽长 RBL	Chr.2	1	6329713	Intronic	5.91
	Chr.4	1	16684507	Intergenic	5.30
	Chr.6	1	6516813	Intergenic	5.07
	Chr.8	3	30641085	Intergenic	5.04
	Chr.9	1	23666846	Intergenic	5.54
相对发芽指数 RGI	Chr.1	2	14660900	Intergenic	5.03
	Chr.2	3	19121924	Intergenic	5.03
	Chr.3	3	44183090	Intronic	5.03
	Chr.4	2	37968657	Intergenic	5.03
	Chr.5	2	21517788	Intergenic	5.11
	Chr.6	3	31043463	Intergenic	5.03
	Chr.7	3	13729076	Intergenic	5.31
	Chr.8	1	20083532	Intergenic	5.14
	Chr.9	4	32342111	Downstream	5.38

1.2 谷子萌发期耐盐性鉴定

于2022年在山西农业大学农业基因资源研究中心恒温发芽室内进行谷子萌发期耐盐性鉴定。挑选发芽率在90%上，健康饱满的种子，以双层滤纸为发芽床在经过灭菌处理的9 cm培养皿上进行萌发实验。通过预试验，在NaCl溶液胁迫浓度为170 mmol/L时，谷子发芽表型性状差异较大，故采用170 mmol/L作为盐胁迫浓度。试验组每个培养皿加入7 mL的170 mmol/L灭菌NaCl溶液模拟盐胁迫，对照组每个培养皿加入等量无菌蒸馏水。在25±2℃、70%湿度、昼/夜16/8 h条件下进行培养，在第6天补充1 mL无菌水以弥补蒸发的水分，使滤纸保持湿润，不再额外添加盐分，试验设置3次重复。所有谷子资源分5批次完成耐盐鉴定试验，在每批次试验当中放入同一谷子品种红谷作为内参照物，检验不同批次之间试验条件是否一致。

1.3 测定指标与方法

以根长达到种子等长，芽长达到种子1/2的长度为发芽标准，期间第2、4、6、8天定时记录发芽种子数。在培养第4天和第8天分别统计种子在盐胁迫和对照中的发芽数量，并计算发芽势、发芽率、发芽指数、相对发芽势、相对发芽率和相对发芽指数。在培养的第8天从每个培养皿中随机挑选10株发芽的种子，用直尺测量种子在盐胁迫和对照中的根长和芽长，并计算其相对根长和相对芽长。发芽指数按照以下公式进行计算：发芽指数=G₂/D₂+G₄/D₄+G₆/D₆+G₈/D₈；式中G₂、G₄、G₆、G₈为在发芽的第2、4、6、8天的发芽种子数，D₂、D₄、D₆、D₈为对应的发芽天数。所有指标的相对值计算方法均为在盐胁迫下的该指标绝对值与对照条件下该指标的绝对值的比值。

采用隶属函数法^［

21-22］对333份山西谷子种质资源进行耐盐综合评价，隶属函数值按照参考文献中的方法进行计算，计算公式如下。

μ(X_j)=(X_j-X_min)/(X_max-X_min)　 j=1，2，3，…，n（1）

其中，μ（X_j）表示第j个综合指标在某一份种质中的隶属函数值，X_j表示在某一份种质第j个综合指标值；X_max和X_min分别表示所有品种第j个综合指标的最大值和最小值。一个综合指标对应一个隶属函数值μ（X_j），且μ（X_j）介于0到1之间。然后，根据各性状的相对重要性，赋予一定的权重。

某一特定品种的权重的计算公式为：

W_j=P_j/ $\sum_{j = 1}^{n} P_{j}$ j=1，2，3，…，n（2）

其中，W_j表示第j个综合指标的重要程度；P_j为第j个综合指标的相关系数，代表在所有品种中该指标的贡献率。

最后，将各指标的隶属函数值与权重相乘之后的总和，作为评价各品种的综合评价值（D值）。

D= $\sum_{j = 1}^{n} [μ (X_{j}) \times W_{j}]$ 　 j=1，2，3，…，n（3）

其中，D表示在NaCl溶液胁迫下不同品种耐盐能力的综合评价值。谷子品种的耐盐能力可以根据各品种的综合评价值（D值）的大小而定。D值越大，品种耐盐能力越强，反之，D值越小，品种耐盐能力越弱。

使用Microsoft Excel 2010软件进行数据的处理和计算，利用Origin 2021软件绘制相关指标的正态分布图。

1.4 基因组测序和SNP基因型的获得

每个品种在进入灌浆期后第1周内取倒二叶作为测序样本。取333份谷子单株叶片样本提取基因组DNA，由深圳华大生命科学研究院采用DNBseqTM高通量测序平台完成所有材料的全基因组重测序。所有测序数据均保存在国家基因库生命大数据平台（https：//db.cngb.org/cnsa），可通过登录项目号CNP0001848访问。去除接头及低质量数据，将High-quality reads与“张谷”参考基因组（Setaria italica cv. Zhang gu， version 2.3， ftp：//ftp.genomics.org.cn/pub/Foxtail_millet.）进行比对，比对数据经重新排序及去除PCR重复后，进行比对统计，获得群体样品的初始变异数据集。采用GATK软件4.1.2.0进行变异数据集质量过滤，保留Bia-alleles变异位点。进一步采用BCFtools软件1.9进行DP深度位点过滤，保留SNP位点缺失率10%以下，及最小等位基因频率在5%以上的SNP数据集，最终获取后续全基因组关联分析的高质量3160066个SNP位点基因型用于关联分析。

1.5 表型性状与全基因组关联分析

选用混合线性模型MLM（Q+K），利用基因组重测序结果从中开发群体SNP标记。使用SVS8.4.0软件包中EMMAX模块，将每个表型性状的平均值与重测序基因组进行关联分析，利用R语言中的CMplot绘制每个性状的曼哈顿图和Q-Q图。根据Bonferroni校正法，阈值设置为1/Ne，Ne为GEC软件计算出的有效标记数774692，则P=-log₁₀（1/Ne）=5.89，为消除Bonferroni校正过于严格导致的假阴性，挖掘更多影响芽期耐盐性的候选基因，结合本研究关联分析结果，设置当阈值-log₁₀（P）=5时，判定其与所研究性状显著关联。通过曼哈顿图标注显著关联SNP位点，并将关联分析的效果通过Q-Q图展示。

1.6 候选基因预测与单倍型分析

由于该批种质资源的连锁不平衡衰减（LD，linkage disequilibrium）距离为20.3Kb，因此认为峰值SNP附近20.3 Kb以内的QTL为同一个QTL。将最显著的单核苷酸多态性位点与“张谷”参考基因组进行比对，以每个QTL内最显著SNP所在基因或临近基因作为该QTL的首要候选基因，将比较得到的候选基因依次和InterPro数据库（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）、Nr（NCBI non-redundant protein）数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/about/nonredundantproteins/）、KEGG数据库（https：//www.genome.jp/kegg/kegg1a.html）、COG数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）中的蛋白序列进行比对，从而获得与候选基因对应的蛋白功能注释及功能分类统计，预测出与目标性状关联度较高的候选基因。对该候选基因进行单倍型分析，得到该基因的优势单倍型。

2 结果与分析

2.1 谷子芽期耐盐性鉴定结果

333份山西谷子耐盐综合评价的D值的频率分布如图1A所示，D值的范围是0.1238~0.8632。D值最大的为来自阳泉市的青软谷（CC183，D值=0.8632），表明其耐盐性最强；D值最小的为来自运城市的爪爪谷（CC582，D值=0.1238），表明其耐盐性最弱。根据5个耐盐相关性状综合评价D值分布（图1B），以D值的平均值（ $\bar{D}$ ）和标准差（SD）为参照对333份山西谷子种质耐盐性进行分类，将其耐盐性分为5个等级。D_i≥ $\bar{D}$ +1.64SD，即D值≥0.7324为高度耐盐品种，包括17个品种； $\bar{D}$ +1.64SD＞D_i≥ $\bar{D}$ +1SD，即0.7324＞D值≥0.6351为耐盐品种，包括37个品种； $\bar{D}$ +1SD＞D_i≥ $\bar{D}$ -1SD，即0.6351＞D值≥0.3309为中等耐盐品种，包括223个品种； $\bar{D}$ -1SD＞D_i≥ $\bar{D}$ -1.64SD，即0.3309＞D值≥0.2336，为盐敏感品种，包括36个品种；D_i＜ $\bar{D}$ -1.64SD，即D值＜0.2336为高度盐敏感品种，包括20个品种。不同谷子品种的来源和萌发期耐盐性综合评价D值详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr. 20240407002，附表1。

图1 基于D值的333份山西谷子种质耐盐性分类情况

Fig. 1 Salt tolerance classification of 333 Shanxi foxtail millet germplasm based on D values

A：D值分布情况；B：基于D值的333份山西谷子种质耐盐性级别

A：Distribution of D values； B：Salt tolerance level of 333 Shanxi foxtail millet germplasm based on D values

2.2 谷子萌发期耐盐表型数据评估

333份谷子在170 mmol/L NaCl溶液胁迫下，共测量和计算得到5个耐盐性相关表型的指标，分别为相对发芽势、相对发芽率、相对根长、相对芽长、相对发芽指数。对谷子萌发期的这5个表型性状进行描述统计分析，结果如图2所示，经过盐处理后的谷子发芽的相关指标表现出较为广泛的表型变异，均呈正态分布，符合数量遗传性状的特征，适于利用GWAS分析挖掘相关位点及候选基因。

图 2 山西谷子种质耐盐相关性状的分布

Fig. 2 Distribution of the salt tolerance traits in the Shanxi foxtail millet variety

RGP：Relative germination potential；RGR：Relative germination rate；RRL：Relative root length；RBL：Relative bud length；RGI：Relative germination index；The same as below

2.3 谷子萌发期耐盐性状GWAS分析

对谷子萌发期耐盐相关性状进行整理后，结合333份谷子基因组重测序数据，采用单位点混合线性模型MLM（Q+K）进行GWAS分析，Q-Q图显示关联分析所选取的统计模型较为合理。对关联位点的-log₁₀（P）值进行预测，认定当阈值大于5时，可判断SNP位点与耐盐响应相关表型存在显著关联。筛选出的SNP位点通过曼哈顿图展示（图3）。结果显示，筛选出与谷子萌发期5个性状显著关联的SNP位点86个，检测出5个与相对发芽势关联的SNP，分别位于1、3、4、7、9号染色体；检测出9个与相对发芽率关联的SNP，其中2个位于1号染色体、1个位于3号染色体、1个位于5号染色体，1个位于7号染色体，3个位于8号染色体，1个位于9号染色体；检测出42个与相对根长关联的SNP，其中有36个SNP分布在6号染色体上；检测出7个与相对芽长关联的SNP，分别位于2、4、6、8、9号染色体上；检测出23个与相对发芽指数关联的SNP，在1～9号染色体上均有分布。通过GWAS分析结果发明，5个谷子萌发期耐盐性相关表型指标都关联到了相应的SNP位点，这5个指标可以作为谷子萌发期耐盐性分析的GWAS关联分析的指标。5个耐盐表型性状在每条染色体上的显著SNP（Peak SNPs）如表1所示，其中在染色体上注释到基因间区SNP位点（Intergenic）有20个，上游区下游区（Downstream）SNP位点有4个，内含子（Intronic）SNP位点有4个、外显子（Exonic）SNP位点有1个，拼接区（Splicing）SNP位点有1个。

图 3 谷子萌发期5个耐盐性状全基因组关联分析的曼哈顿图和Q-Q图

Fig. 3 Manhattan and Q-Q plots for genome-wide association analyses of five salt tolerance traits in cereal germination

A：相对发芽势；B：相对发芽率；C：相对根长；D：相对芽长；E：相对发芽指数；红色虚线代表显著阈值-log₁₀（P）=5

A： RGP；B： RGR；C： RRL；D： RBL；E：RGI； The red dashed line represents the significance threshold -log10（P）=5

2.4 筛选谷子萌发期耐盐候选基因

对表1中列出的峰值SNP进行深入分析，在每个最显著峰值SNP位点上、下游20.3 kb区间，搜索和预测可能与谷子萌发期耐盐表型性状相关联的基因，在这些显著性SNP位点附近关联到49个不同的基因（表2）。使用InterPro数据库、Nr数据库、KEGG数据库、COG数据库中蛋白数据对关联到的基因进行功能注释，研究发现，有27个基因没有注释信息（#N/A），有4个基因的注释信息为无特征蛋白（Putative uncharacterized protein），其余18个基因均有蛋白功能注释。其中位于5号染色体外显子位置的SNP与相对发芽率关联得到的基因Millet_GLEAN_10019153编码蛋白激酶超家族蛋白（表2），该蛋白家族具有蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、激酶活性、ATP结合等功能。蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶被多次报道与植物耐盐性相关，因此推测Millet_GLEAN_10019153可能与谷子萌发期耐盐性相关，可作为控制谷子耐盐性的候选基因。

表2 候选基因功能注释

Table 2 Functional annotation of the candidate gene

性状 Traits	染色体 Chromosome	显著SNP位置（bp） Peak SNP position	候选基因名称 Gene name	功能注释 Function annotation
相对发芽势 RGP	Chr.1	33820086	Millet_GLEAN_10019231（dist=53）	#N/A
	Chr.3	6186397	Millet_GLEAN_10016827（dist=3049）	#N/A
	Chr.3	6186397	Millet_GLEAN_10016828（dist=23467）	PEBP （phosphatidylethanolamine-binding protein） family protein
	Chr.4	19582794	Millet_GLEAN_10038426（dist=40428）	Cytochrome P450， family 709， subfamily B， polypeptide 3
	Chr.4	19582794	Millet_GLEAN_10038427（dist=6184）	Putative uncharacterized protein
	Chr.7	16687788	Millet_GLEAN_10002740（Millet_GLEAN_10002740：exon3：c.142-1G>C）	B6TVW1_MAIZE PIF-like orf1 OS=Zea mays PE=2 SV=1
	Chr.9	17264701	Millet_GLEAN_10018083	#N/A
相对发芽率 RGR	Chr.1	33820086	Millet_GLEAN_10019231（dist=53）	#N/A
	Chr.3	32161954	Millet_GLEAN_10024921（dist=32236）	#N/A
	Chr.3	32161954	Millet_GLEAN_10024922（dist=2139）	#N/A
	Chr.5	34363071	Millet_GLEAN_10019153	Protein kinase superfamily protein
	Chr.7	31110581	Millet_GLEAN_10018281（dist=4156）	B6TZ71_MAIZE Glycerol kinase OS=Zea mays PE=2 SV=1
	Chr.7	31110581	Millet_GLEAN_10018282（dist=1909）	Putative uncharacterized protein
	Chr.8	39730408	Millet_GLEAN_10007724（dist=25303）	Putative uncharacterized protein
	Chr.8	39730408	Millet_GLEAN_10007723（dist=13863）	Copper transport protein family
	Chr.9	32409782	Millet_GLEAN_10031019（dist=111）	#N/A
相对根长 RRL	Chr.1	11531491	Millet_GLEAN_10003594（dist=11645）	Basic helix-loop-helix （bHLH） DNA-binding superfamily protein
	Chr.1	11531491	Millet_GLEAN_10003593（dist=4771）	#N/A
	Chr.2	17455495	Millet_GLEAN_10030516（dist=6157）	#N/A
	Chr.2	17455495	Millet_GLEAN_10030515（dist=8373）	RNA binding domain
	Chr.3	36730502	Millet_GLEAN_10004344（dist=15507）	#N/A
	Chr.3	36730502	Millet_GLEAN_10004345（dist=10236）	#N/A
	Chr.6	3304736	Millet_GLEAN_10006203（dist=4929）	Fatty acid desaturase A
	Chr.6	3304736	Millet_GLEAN_10006204（dist=3890）	RNA-binding CRS1
	Chr.8	13407866	Millet_GLEAN_10007652	UB-like protease 1B （ULP1B）
相对芽长 RBL	Chr.2	6329713	Millet_GLEAN_10008205	#N/A
	Chr.4	16684507	Millet_GLEAN_10034179（dist=3253）	TRICHOME BIREFRINGENCE-LIKE 34 （TBL34）
	Chr.4	16684507	Millet_GLEAN_10034178（dist=48600）	#N/A
	Chr.6	6516813	Millet_GLEAN_10020399（dist=7275）	#N/A
	Chr.6	6516813	Millet_GLEAN_10020400（dist=7984）	Coatomer， beta' subunit
	Chr.8	30641085	Millet_GLEAN_10036050（dist=3633）	Plant protein of unknown function 247 （DUF247）
	Chr.8	30641085	Millet_GLEAN_10036049（dist=9900）	#N/A
	Chr.9	23666846	Millet_GLEAN_10008459（dist=2613）	#N/A
	Chr.9	23666846	Millet_GLEAN_10008460（dist=13004）	#N/A
相对发芽指数 RGI	Chr.1	14660900	Millet_GLEAN_10028134（dist=37892）	F-box/RNI-like superfamily protein
	Chr.1	14660900	Millet_GLEAN_10028133（dist=31780）	#N/A
	Chr.2	19121924	Millet_GLEAN_10029252（dist=1301）	#N/A
	Chr.2	19121924	Millet_GLEAN_10029253（dist=5069）	#N/A
	Chr.3	44183090	Millet_GLEAN_10006642	Autoinhibited Ca2+-ATPase 1 （ACA1）
	Chr.4	37968657	Millet_GLEAN_10002552（dist=3508）	#N/A
	Chr.4	37968657	Millet_GLEAN_10002551（dist=1626）	#N/A
	Chr.5	21517788	Millet_GLEAN_10017579（dist=12713）	#N/A
	Chr.5	21517788	Millet_GLEAN_10018128（dist=25902）	#N/A
相对发芽指数 RGI	Chr.6	31043463	Millet_GLEAN_10022175（dist=8204）	F-box/RNI-like superfamily protein
	Chr.6	31043463	Millet_GLEAN_10022174（dist=9621）	F-box family protein
	Chr.7	13729076	Millet_GLEAN_10007263（dist=9393）	#N/A
	Chr.7	13729076	Millet_GLEAN_10007262（dist=74698）	S-domain 2-5 （SD2-5）
	Chr.8	20083532	Millet_GLEAN_10029012（dist=1626）	#N/A
	Chr.8	20083532	Millet_GLEAN_10029013（dist=8873）	Dolichol phosphate-mannose biosynthesis regulatory protein-related
	Chr.9	32342111	Millet_GLEAN_10031012（dist=557）	#N/A

#N/A：没有注释信息

#N/A：No annotation information

2.5 候选基因的单倍型分析

将候选基因Millet_GLEAN_10019153的基因序列与基因组数据库中序列的编码区段进行比对分析，结果显示，Millet_GLEAN_10019153中鉴定出18个SNP（图4），进一步的单倍型分析结果显示，候选基因Millet_GLEAN_10019153在333份谷子群体中存在4种单倍型，其中Hap_1为主要单倍型，有32个品种；其次是有18个品种的Hap_2，以及有12个品种的Hap_3和有2个品种的Hap_4。由于该基因为相对发芽率进行GWAS分析所得，进一步分析比较核苷酸多态性与相对发芽率之间的相关性，以确定这些单倍型之间差异性是否显著。Hap_1单倍型32个品种的相对发芽率平均值为49.64%，Hap_2单倍型18个品种的相对发芽率平均值为64.16%，Hap_3单倍型12个品种的相对发芽率平均值为54.23%，使用曼-惠特尼秩和检验（P=0.005）对不同单倍型相对发芽率的差异显著性进行分析，这3种单倍型之间两两差异显著。根据相对发芽率的平均值，得出Hap_2是优异单倍型。而Hap_4单倍型的品种数量小于3个，未做差异显著性分析。

图4 Millet_GLEAN_10019153编码区的核苷酸多态性

Fig. 4 Nucleotide diversity within the coding region of Millet_GLEAN_10019153

3 讨论

3.1 谷子萌发期耐盐指标筛选

谷子是研究对各种非生物胁迫耐受性的重要模式作物，然而谷子对盐胁迫相应的研究相对较少，在表型和分子水平上研究谷子对盐胁迫的响应具有重要意义。表型的精准鉴定对研究作物耐盐性至关重要，在萌发期对谷子耐盐性进行鉴定，具有操作简单和测定周期短的优势，适合大批量的耐盐种质的筛选。目前，已有研究者在谷子萌发时期开展了一些耐盐筛选和鉴定的研究，如吕宗环等^［

8］以108份谷子为材料，在萌发过程中使用180 mmol/L NaCl溶液胁迫处理，对萌发期的相对发芽率、相对发芽势、相对芽长和相对根长进行模糊隶属函数分析，得到5份极端耐盐材料。崔兴国等^{［参考文献 23

百度学术}23］以14份衡水地区谷子地方品种为材料利用150 mmol/L NaCl溶液处理，采用了发芽率、发芽指数及其相对值作为耐盐鉴定的相关指标。本研究是以谷子萌发期的发芽势、发芽率、根长、芽长、发芽指数在盐胁迫（170 mmol/L NaCl溶液）和对照条件下的相对值作为耐盐评价指标评价谷子耐盐能力。

3.2 谷子种质资源耐盐性全基因组关联分析

本研究在170 mmol/L的NaCl溶液浓度下，对333份山西核心谷子资源进行盐胁迫处理，发现测定的5个与耐盐相关性状（相对发芽势、相对发芽率、相对根长、相对芽长、相对发芽指数）呈正态分布，表明耐盐性状属于多基因控制的数量性状，能够进行全基因组关联分析。GWAS通过重测序识别高分辨率SNP，可以一次关联定位多个表型性状，可用于全基因组水平上对复杂数量性状遗传变异的关联分析，目前已经被广泛用于识别作物性状相关的遗传基因^［

24］。如应用于对非生物胁迫的响应^{［参考文献 25-28}25-28］、生物应激^{［参考文献 15

百度学术}15］以及许多其他农艺性状特征^{［参考文献 29-30}29-30］等。在利用GWAS研究植物耐盐性方面，Yu等^{［参考文献 27

百度学术}27］测量了268份水稻材料的8个耐盐性相关性状，通过GWAS研究发现OsWRKY53是水稻耐盐性的关键调控因子，鉴定到83个相关位点，通过基因注释评估他们可能得功能，找到10个与水稻耐盐性相关的候选基因，其中OsWRKY53和OsMKK10.2是两个新发现的耐盐性候选基因。Zheng等^{［参考文献 31

百度学术}31］对149份陆生棉花苗期耐盐性状进行全基因组关联分析，共检测到27个与耐盐性状密切相关的SNP标记和15个耐盐指数密切相关的SNP标记；检测到与植物耐盐性相关的基因Gh_D01G0943、Gh_D01G0945、Gh_A01G0906、Gh_A01G0908、Gh_D08G1308和Gh_D08G1309，它们分别参与细胞内转运、蔗糖合成、渗透压力平衡、跨膜转运、n -糖基化、生长素响应和细胞扩增。Wang等^{［参考文献 32

百度学术}32］对150份地方水稻品种苗期盐相关性状进行测定并进行GWAS分析，鉴定出65个与耐盐性显著相关的QTL，通过单倍型分析、qRT-PCR分析和序列比对，确定了4个候选基因（LOC_Os06g47720、LOC_Os06g47820、LOC_Os06g47850、LOC_Os06g47970）与水稻耐盐性相关。然而，利用GWAS对谷子耐盐SNP挖掘方面的研究还非常缺乏^{［参考文献 33

百度学术}33］。

3.3 与谷子萌发期耐盐性有关的候选基因

本研究基于GWAS分析绘制的曼哈顿图发现当阈值设为-log₁₀（P）=5时，超过阈值部分在所有染色体上均有分布。其中，利用相对发芽率关联到1个显著性SNP位点，即Chr.5：34363071；根据基因注释结果，发现了1个与谷子萌发期耐盐相关的基因Millet_GLEAN_10019153。根据功能注释信息，Millet_GLEAN_10019153编码的是蛋白激酶超家族蛋白，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，其注释功能与耐盐直接相关。在拟南芥中，SOS1 （Salt overly sensitive1）、SOS2 和SOS3是调控植物细胞内离子平衡和耐盐能力的重要基因，其中SOS2基因在细胞内Na⁺和K⁺平衡必不可少^［

34］，编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于SNF1/AMPK家族中的一员^{［参考文献 35

百度学术}35］。在近期的谷子耐盐基因研究中，发现转录因子SiDi19-3与SiPLATZ12相互作用，控制转基因拟南芥和谷子幼苗的耐盐性。SiDi19-3的过表达增加了大多数Na⁺/H⁺反转运体（NHX）的转录水平，同时改善了谷子和拟南芥幼苗的耐盐能力，增加了盐过度敏感和钙调素B样蛋白（CBL， B-like protein）基因的转录水平^{［参考文献 36

百度学术}36］。迄今为止，对谷子耐盐胁迫抗性基因的鉴定研究较少。一项近期的研究发现，谷子中R2R3-MYB的转录因子SiMYB16在水稻中过表达，显著提高了转基因水稻苗期和田间全生育期的耐盐能力^{［参考文献 37

百度学术}37］。在另一项研究中，在谷子基因组中鉴定出的12个PTI1 （Pto-interacting1）基因，其有一个基因SiPTI1-5在异源宿主酵母和大肠杆菌中过表达，增强了宿主的盐胁迫耐受性^{［参考文献 38

百度学术}38］。这些研究证明，谷子盐响应基因可能在主要作物耐盐品种的培育中发挥作用，亟需开发和鉴定。本研究结果对耐盐谷子种质的鉴选及耐盐基因挖掘具有一定参考意义。

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