摘要
苦荞（Fagopyrum tataricum）是蓼科荞麦属的一年生草本植物，是一种药食同源的优质作物。荞麦立枯病的发生严重影响苦荞种植的推广与发展。本研究对茉莉酸或水杨酸处理后的苦荞进行转录组分析，发现天冬氨酸蛋白酶基因FtAPDSLX1的表达模式受到茉莉酸或水杨酸的诱导。对不同抗性水平苦荞中的FtAPDSLX1表达量分析结果显示，立枯丝核菌抗性材料中FtAPDSLX1的表达量显著高于立枯丝核菌易感材料。以苦荞代表性品种川荞一号为材料，克隆得到FtAPDSLX1基因。生物信息学分析结果显示，FtAPDSLX1基因的CDS序列中包含1143 个碱基对，编码380个氨基酸构成的蛋白质，该基因启动子具有多个与抗病相关的顺式元件。对FtAPDSLX1的表达模式进行分析发现，苦荞幼苗中的FtAPDSLX1基因表达量受到立枯丝核菌侵染的诱导，且具有显著的组织特异性。对转FtAPDSLX1基因拟南芥株系进行抗病表型分析，结果表明FtAPDSLX1提高了转基因拟南芥的立枯丝核菌抗性，同时病菌胁迫下转基因拟南芥中FtAPDSLX1的表达量显著提高，并且FtAPDSLX1提高了转基因拟南芥中超氧化物歧化酶、过氧化物酶的酶活性。以上结果显示，苦荞受到立枯丝核菌侵染时，FtAPDSLX1可能参与了对立枯丝核菌的防御机制。FtAPDSLX1的功能验证及相关研究为苦荞抗立枯丝核菌的分子机制解析以及抗病种质资源的筛选奠定了工作基础。
关键词
荞麦（Fagopyrum Mill）为蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum）的一年生或多年生草本或半灌木植物，在中国西南部、中国北部、欧洲、俄罗斯、尼泊尔和不丹等高海拔地区，被当地居民用作主
荞麦病害不仅会降低荞麦本身营养成分，同时会导致荞麦大规模减产。荞麦病害具有发病种类多、患病影响大的特点，到目前为止，国内外报道的荞麦病害共19种，共分为14种真菌病害、5种其他病
茉莉酸（JA， jasmonic acid）是响应植物逆境胁迫的重要激
本研究以栽培种苦荞种质川荞1号为试验材料进行PCR扩增，克隆得到FtAPDSLX1，并对其理化性质和生理功能进行了深入探索。通过亚细胞定位技术，观察FtAPDSLX1在细胞中的分布情况。通过荧光定量PCR对FtAPDSLX1在苦荞中的表达模式进行分析。构建FtAPDSLX1转基因拟南芥对其立枯丝核菌抗性进行鉴定。对该基因的深入研究不仅对解析苦荞抗立枯丝核菌的分子机制具有重要作用，同时为栽培种苦荞抗病种质筛选提供了理论基础。
本研究所使用的苦荞种质资源（NPL324、GS181、GZ269、HB93、SX122、SX96、HB384、YN306、QH361、GS194以及川荞1号）、立枯丝核菌菌株（Rhizoctonia solani AG4-HGI3）、感受态细胞（DH5α、GV3101）、核定位细胞以及载体（pCAMBIA1307、pCAMBIA1305）等均由中国农业科学院作物科学研究所荞麦基因资源组提供。
选取健康饱满的川荞一号荞麦种子，于2023年在室温为28℃，相对湿度为75%~80%，光照16 h/黑暗8 h 的环境下培养一周，并选取长势正常的50~100 mg苦荞幼苗，利用RNAprep Pure Plant Kit试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取幼苗RNA，进行吸光值检测和琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用FastKing One Step RT-PCR Kit试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）反转录为cDNA，并于-20℃保存备用。
选用颗粒饱满且大小均匀的种子，剥去种皮后，用75%乙醇浸泡清洗5 min，然后在10%次氯酸钠浸泡15 min杀菌消毒，最后使用无菌水反复清洗数次，吹干水分后将其均匀铺种于MS培养基上，于28 ℃、相对湿度75%~80%、光照16 h/黑暗8 h环境下的组培间中培养。将发育良好的无菌苗整株放入分别加有1 mmol/L水杨酸和50 μmol/L茉莉酸的MS液体培养基中，于28℃摇床中培育，分别于0 h、1 h、4 h和12 h进行整株幼苗取样，并立即用液氮速冻，随后送至北京安诺优达基因科技有限公司转录组测序。
使用SnapeGene软件设计CDS的全长扩增引物（
引物名称 Primer | 引物序列 Primer sequence （5' -3'） | 用途 Function |
|---|---|---|
|
FtAPDSLX1-F FtAPDSLX1-R 1307-FtAPDSLX1-F 1307-FtAPDSLX1-R 1307-F 1307-R FtH3-qPCR-F FtH3-qPCR-R Actin7-qPCR-F Actin7-qPCR-R qPCR-FtAPDSLX1-F qPCR-FtAPDSLX1-R 1305-FtAPDSLX1-F 1305-FtAPDSLX1-R |
ATGGCGGAGGCAATCACGA TTAGTAGAGTGGCCCAATG GACTTGAACTCGGTATCTAGAATGGCGGAGGCAATCACGA CTTGATATCGAATTCCTGCAGTTAGTAGAGTGGCCCAATG CTCAAGCAATCAAGCATTCTAC GAGAGACTGGTGATTTTTGCG GAAATTCGCAAGTACCAGAAGAG CCAACAAGGTATGCCTCAGC TCCATGAAACAACTTACAACTCCATCA CATCGTACTCACTCTTTGAAATCCACA GAAGCACCCAACTCAAGCATAGCT ACCCTTTCCCGAGGCACTCA CGGAGCTAGCTCTAGAATGGCGGAGGCAATCACGA TGCTCACCATGGATCCTTAGTAGAGTGGCCCAATG |
基因克隆
构建过表达载体
1307通用引物
qRT-PCR苦荞内参基因
qRT-PCR拟南芥内参基因
qRT-PCR
亚细胞定位载体引物 |
在荞麦基因组和表型数据库网站（http：//47.93.16.146/）查询得到FtAPDSLX1 CDS序列，运用ExPASy网站（https：//web.expasy.org/protparam/）查询FtAPDSLX1蛋白理化性质，用PHYRE2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）网站查询FtAPDSLX1蛋白二级结构并使用Swiss Model（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）对其三级结构进行作图。使用PLANTCARE网站（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对FtAPDSLX1基因启动子序列进行分析，通过UNIPROT在线网站（https：//www.uniprot.org/blast/uniprotkb/）将FtAPDSLX1蛋白序列与不同物种进行比对，并使用MEGA11软件进行系统发育树的绘制。
选择5份对立枯丝核菌具有抗性的材料NPL324、GS181、GZ269、HB93、SX122以及5份对立枯丝核菌表现为易感的材料SX96、HB384、YN306、QH361、GS194在室温为28℃、相对湿度为75%~80%、光照16 h/黑暗8 h的环境下培养一周后，选取长势正常的整株幼苗进行RNA提取以及反转录。利用SnapGene软件设计候选基因FtAPDSLX1的荧光定量引物对qPCR-FtAPDSLX1-F/R（
用立枯丝核菌菌液浸泡培育3周后长势良好的整株苦荞麦川荞1号无菌苗，分为4组，每组3株，于28 ℃环境下培养0 h、6 h、12 h、24 h后分别对叶、茎、根进行取样，并提取总RNA，以测定FtAPDSLX1基因在苦荞不同组织中的相对表达量，方法同1.5.1。
将FtAPDSLX1转基因拟南芥株系（OE1、OE2、OE3）和野生型拟南芥（WT）在室温为28℃、相对湿度为75%~80%、光照16 h/黑暗8 h的环境下培养3周。同一花盆中种植4株拟南芥为一组，分别为OE1、OE2、OE3、WT，共种植12盆48株苗。利用立枯丝核菌侵染以上所有的拟南芥（方法同上），分别在0 h、6 h、12 h、24 h 四个不同时间段取样，每个时段分别取3盆，即为3次生物学重复。将所得到的样品进行RNA提取并进行反转录得到cDNA，利用qRT-PCR方法对不同侵染时间段下的野生型拟南芥（WT）和FtAPDSLX1转基因拟南芥株系的相对表达量进行分析，方法同1.5.1。
利用SnapeGene软件根据FtAPDSLX1基因的非保守区间，设计荧光定量引物对 FtAPDSLX1-qPCR-F/R，荞麦组成型表达基因 FtH3 作为内参基因（
利用亚细胞定位引物1305-FTAPDSLX1-F/R，以反转录得到的川荞一号cDNA为底物（反应体系及反应条件见1.4），构建亚细胞定位融合载体 pCAMBIA1305-FtAPDSLX1-GFP。以1305-GFP空载体采用农杆菌介导法通过注射使其瞬时共转化到本氏烟草叶片背面作为对照组，亚细胞定位融合载体 pCAMBIA1305-FtAPDSLX1-GFP瞬时共转化到本氏烟草叶片背面作为试验组，试验组与对照组中均加入含有核定位序列 （NLS，nuclear localization signal）的农杆菌菌液作为核marker，避光培养12 h后，置于正常条件下培养48 h。使用激光共聚焦显微镜进行观察。
将FtAPDSLX1转基因株系OE1、OE2、OE3种子和野生型对照 WT种子经无水乙醇消毒干燥后均匀撒在MS 固体营养板上。大概3周后，将长出真叶的FtAPDSLX1转基因株系和 WT的幼苗移植于花盆中，并在室温22 ℃、相对湿度为75%~80%、16 h光照/8 h黑暗的环境下进行培养，得到FtAPDSLX1转基因株系和 WT拟南芥，选取FtAPDSLX1转基因株系和WT的离体叶片作为样品进行表型分析。将储存的立枯丝核菌菌株活化后涂布于PDB培养基上进行培养，得到活力较高的立枯丝核菌菌板。选取FtAPDSLX1转基因株系和WT的离体叶片各18片分别置于培养皿中，并在叶片下垫入湿润的滤纸以保持叶片湿度，将叶片均分为两组，试验组利用大小一致、活性正常的立枯丝核菌菌饼对离体叶片表面进行接种，以观察FtAPDSLX1转基因株系和野生型WT病菌侵染下的发病情况，对照组为立枯丝核菌菌块接种0 h。将培养皿利用封口膜进行封闭保湿处理后，于28 ℃环境下暗培养24 h后观察试验组与对照组的发病情况，并对FtAPDSLX1转基因株系和野生型WT的发病率及病斑面积占比进行统计，发病率=叶片发病数/叶片总数。利用DAB染色液对处理过后的FtAPDSLX1转基因株系和WT的离体叶片进行染色以进一步观察病斑情况。为了验证转基因拟南芥与野生型拟南芥的抗病性差异是否与FtADSPLX1的表达量相关，通过qRT-PCR对立枯丝核菌侵染0 h、6 h、12 h、24 h的野生型拟南芥WT和转基因拟南芥株系OE1、OE2、OE3进行FtAPDSLX1表达模式测定。为了进一步确定转基因拟南芥的抗性是否显著提高，对转基因拟南芥与野生型拟南芥中的超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、丙二醛含量进行检测。对野生型拟南芥和转基因拟南芥均进行24 h立枯丝核菌侵染处理，对照组为立枯丝核菌侵染0 h。各组取样9株，利用北京索莱宝科技有限公司POD活性检测试剂盒、SOD活性检测试剂盒以及MDA含量检测试剂盒进行抗病相关指标检测。
转录组分析结果显示，苦荞中的FtAPDSLX1于茉莉酸处理1 h后表达量达到最大值（
图1 茉莉酸/水杨酸处理后苦荞中FtAPDSLX1转录分析
Fig. 1 Transcriptome analysis of FtAPDSLX1 in tartary buckwheat after JA/SA treatment
ns表示无差异；**表示P<0.01水平上差异极显著；下同
ns indicates no difference； ** indicates a highly significant difference at the P<0.01 level； The same as below
为了检验FtAPDSLX1在不同抗性水平材料中的表达量是否存在差异，通过qRT-PCR对立枯丝核菌抗性材料与易感材料中的FtAPDSLX1表达量进行分析（
图2 FtAPDSLX1在不同抗病等级苦荞种质中的表达模式
Fig. 2 Expression pattern of FtAPDSLX1 in tartary buckwheat germplasm with different disease resistance grades
PCR扩增得到FtAPDSLX1基因全长CDS，通过琼脂糖凝胶电泳将PCR扩增产物分离。根据
图3 FtAPDSLX1基因PCR产物电泳结果
Fig. 3 Electrophoresis results of PCR products of FtAPDSLX1 gene
1：目的条带
M：DL 2000 maker；1： Target band
生物信息学分析得到FtAPDSLX1基因及其编码蛋白的详细信息。FtAPDSLX1基因的CDS序列长度为1143 bp（1143碱基对），编码了380个氨基酸构成的蛋白质。对FtAPDSLX1蛋白的性质进行分析，结果表明其理论相对分子量约为42.33 kDa；等电点（pI）描述蛋白质在特定pH条件下的电荷状态，FtAPDSLX1蛋白的理论等电点为5.50；蛋白的稳定性可以通过不稳定指数来评估，通常不稳定指数大于40时，表示蛋白是不稳定的，FtAPDSLX1蛋白的不稳定指数为53.32，是一个不稳定蛋白；亲水性/疏水性分析是评估蛋白质在水环境中溶解性的重要步骤，FtAPDSLX1蛋白亲水性为-0.352，是亲水性蛋白。
FtAPDSLX1蛋白的二级结构主要由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成，分别占比27.89%、15.53%、3.16%和53.42%（
图4 FtAPDSLX1同源蛋白结构比对
Fig. 4 Structural alignment of FtAPDSLX1 homologous proteins
A、B分别为FtAPDSLX和FD07G01375蛋白的二级结构；C、D分别为FtAPDSLX和FD07G01375蛋白的三级结构
A，B are the secondary structures of FtAPDSLX， FD07G01375 proteins，respectively；C，D are the tertiary structures of FtAPDSLX，FD07G01375 proteins，respectively
对FtAPDSLX1基因上游序列进行分析，结果显示在FtAPDSLX1基因启动子中除了存在一系列激素响应元件如生长素响应元件TGA-element、赤霉素响应元件P-box、脱落酸应答顺式元件ABRE外，还存在G-box、MYB和MYC等与抗逆相关的顺式作用元件以及病原菌诱导响应元件（
图5 FtAPDSLX1启动子结构
Fig. 5 The structure of FtAPDSLX1 promoter
位点名称 Site name | 位点功能 Function of site | 元件数量 Quantity of element |
|---|---|---|
| MYB | Anti stress related | 6 |
| TGA-element | Auxin-responsive element | 1 |
| ABRE | A cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness | 7 |
| O2-site | Cis-acting regulatory element involved in zein metabolism regulation | 5 |
| P-box | Gibberellin-responsive element | 1 |
| Sp1 | Light responsive element | 5 |
| MYB-binding site | Anti stress related | 3 |
| ARE | Regulatory element essential for the anaerobic induction | 2 |
| GC-motif | Element involved in anoxic specific inducibility | 2 |
| G-box | A cis-acting regulatory element involved in light responsiveness | 3 |
| Box 4 | A part of a conserved DNA module involved in light responsiveness | 1 |
为了解FtAPDSLX1蛋白在物种中的亲缘关系，通过UNIPROT在线网站检索FtAPDSLX1蛋白序列，发现小粒咖啡（Coffea arabica）、大豆（Glycine soja）、向日葵（Helianthus annuus）、胡桃（Juglans regia）、 莴苣（Lactuca sativa）、苹果属植物山定子（Malus baccata）、莲（Nelumbo nucifera）、海枣（Phoenix dactylifera）、梨（Pyrus ussuriensis x Pyrus communis）、芝麻（Sesamum indicum）、菠菜（Spinacia oleracea）以及生姜（Zingiber officinale）等物种的蛋白序列与FtAPDSLX1蛋白序列具有一定的同源性，利用软件MEGA11进行比对分析，并绘制系统进化树（
图6 FtAPDSLX1不同物种同源蛋白分析
Fig. 6 Analysis of homologous proteins of FtAPDSLX1 in different species
天冬氨酸蛋白酶主要分布于植物的细胞质中，根据天冬氨酸蛋白酶的不同功能，其亚细胞定位具有显著差异性。构建亚细胞定位融合载体pCAMBIA1305-FtAPDSLX1-GFP并用农杆菌介导法通过注射使其瞬时共转化到本氏烟草叶片背面，进行培养后使用激光共聚焦显微镜观察发现（
图7 FtAPDSLX1亚细胞定位信号
Fig. 7 Subcellular localization signal of FtAPDSLX1
对实验室已有转录组数据进行分析发现，FtAPDSLX1主要在叶片、茎以及发育期籽粒中表达（
图8 苦荞不同组织与不同时间段中FtAPDSLX1的表达量
Fig. 8 Expression of FtAPDSLX1 in different tissues and at different time points in Fagopyrum tataricum
***和****分别表示P<0.001和P<0.0001水平上差异极显著；ns表示无差异； 下同***和**** indicate highly significant difference at the P<0.001 and P<0.0001 level，respectively；ns indicates no difference；The same as below
为了进一步确定立枯丝核菌侵染过程中FtADSPLX1的响应模式，通过qRT-PCR对FtAPDSLX1在受立枯丝核菌侵染不同时间段的苦荞组织的表达量进行检测。结果表明，苦荞FtAPDSLX1基因在立枯丝核菌胁迫下被诱导从而上调表达。
苦荞幼苗的根、茎、叶在受立枯丝核菌侵染的不同时间段，FtAPDSLX1的表达量呈现显著的组织特异性（
为了鉴定转FtAPDSLX1基因拟南芥的抗病性，利用转FtAPDSLX1基因拟南芥与野生型拟南芥离体叶片进行立枯丝核菌接种。结果显示，接种24 h后，对照组中的离体叶片之间并未呈现出显著不同；试验组WT的离体叶片的立枯丝核菌侵染痕迹较OE1、OE2、OE3的更为明显（
图9 转基因拟南芥立枯丝核菌处理后的表型分析
Fig. 9 Phenotype analysis of transgenic Arabidopsis thaliana after treated with Rhizoctonia solani
WT为野生型拟南芥，OE1、OE2、OE3为不同转FtAPDSLX1基因拟南芥株系，下同；A：拟南芥病菌侵染结果；B：拟南芥发病率；C：拟南芥病斑面积率；D：DAB染色结果
；（图9）
WT represents wild-type Arabidopsis thaliana， while OE1、OE2、OE3 represent different transgenic Arabidopsis thaliana lines expressing the FtAPDSLX gene， the same as below；A： Infection results of Arabidopsis thaliana by pathogens； B： Arabidopsis thaliana incidence rate；C： Arabidopsis thaliana disease spot area ratio； D： DAB staining results
二氨基联苯胺（DAB，diaminobenzidine）在过氧化物酶催化作用下发生化学反应，在反应部位产生棕褐色沉淀物。DAB染色试验结果进一步说明了FtAPDSLX1转基因拟南芥对立枯丝核菌的抗性显著强于野生型拟南芥。试验组中OE1、OE2、OE3和WT叶片上均呈现明显棕褐色沉淀，而对照组中转基因拟南芥和野生型拟南芥离体叶片无显著差异（
qRT-PCR结果显示，立枯丝核菌侵染0~24 h期间，转基因拟南芥中FtAPDSLX1的表达量均显著高于野生型拟南芥，而在12~24 h FtAPDSLX1表达量增长速率下降时期，转基因拟南芥中FtAPDSLX1的表达量达到了野生型拟南芥的3~5倍（
图10 立枯丝核菌侵染下转基因拟南芥株系FtAPDSLX1表达量分析
Fig. 10 Analysis of expression level of transgenic Arabidopsis thaliana line FtAPDSLX1 under Rhizoctonia solani infection
过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性作为活性氧清除相关的抗氧化酶，其活性的升高可降低自由基对细胞膜的损伤，降低植株所受到的氧化损
图11 转基因拟南芥抗病性相关生理指标检测
Fig. 11 Detection of physiological indicators related to disease resistance of transgenic Arabidopsis thaliana
0 h：未处理；24 h：立枯丝核菌侵染24 h
0 h： Untreated； 24 h：Infected with Rhizoctonia solani for 24 hours；POD：Peroxidase；SOD：Superoxide dismutase；MDA：Malondialdehyde
立枯丝核菌是一种能诱导植物严重发病的土传病原真
20世纪90年代，Rodrigo
实验室前期工作证明，苦荞中由茉莉酸介导的天冬氨酸蛋白酶基因FtASP，具有抗病相关功能，其蛋白对真菌的生长起到抑制作
对异源过表达FtAPDSLX1拟南芥的生理指标进行检测发现，在受到立枯丝核菌侵染时，过表达拟南芥株系的过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性显著上升。过氧化物酶和超氧化物歧化酶作为活性氧清除相关的抗氧化酶，其活性的升高可降低自由基对细胞膜损伤，从而降低植株所受到的氧化损
综上，本研究通过转录组分析、生物信息学分析、异源转化拟南芥等手段发掘并研究了FtAPDSLX1的功能，证明其在苦荞对立枯丝核菌的抗性中发挥着重要作用，为苦荞抗病种质的选育提供了理论基础，同时也为其他作物的分子生物育种的基因筛选提供了参考。
参考文献
Zhang K， He M， Fan Y， Zhao H， Gao B， Yang K， Li F L， Tang Y， Gao Q， Lin T， Muriel Q， Janovská D， Meglič V， Kwiatkowski J， Romanova O， Chrungoo N， Suzuki T， Luthar Z， Germ M， Woo S H， Georgiev M I， Zhou M. Resequencing of global tartary buckwheat accessions reveals multiple domestication events and key loci associated with agronomic traits. Genome Biology， 2021， 22（1）：1-17 [百度学术]
Joshi D C， Zhang K， Wang C， Chandora R， Khurshid M， Li J， He M， Georgiev M I， Zhou M. Strategic enhancement of genetic gain for nutraceutical development in buckwheat： A genomics-driven perspective. Biotechnology Advances， 2020， 34（39）： 107479 [百度学术]
Joshi D C， Chaudhari G V， Sood S， Kant L， Pattanayak A， Zhang K， Fan Y， Janovská D， Meglič V， Zhou M. Revisiting the versatile buckwheat： Reinvigorating genetic gains through integrated breeding and genomics approach. Planta， 2019， 250（3）： 783-801 [百度学术]
范昱， 丁梦琦，张凯旋，杨克理，唐宇，方沩，周美亮. 荞麦种质资源概况. 植物遗传资源学报， 2019， 20（4）： 813-828 [百度学术]
Fan Y， Ding M Q， Zhang K X， Yang K L， Tang Y， Fang W， Zhou M L. Overview of buckwheat germplasm resources. Journal of Plant Genetic Resources， 2019， 20（4）： 813-828 [百度学术]
Dong X， Tang Y， Ding M， Li W， Li J， Wu Y， Shao J， Zhou M. Germplasm resources of buckwheat in China and their forage value. Pratacultural Science， 2017， 11（2）： 378-388 [百度学术]
齐杨菊，陈振江，李振霞，刘辉，王莉花，李春杰. 荞麦病害研究进展. 草业科学， 2020， 37（1）： 75-86 [百度学术]
Qi Y J， Chen Z J， Li Z X， Liu H， Wang L H， Li C J. Progress in research on the diseases of buckwheat. Pratacultural Science， 2020， 37（1）： 75-86 [百度学术]
Liu X， Zhou S， Chen S， Yi Z， Pan H， Yao R. Buckwheatdisease recognition based on Convolution Neural Network. Applied Sciences， 2022， 12（9）： 4795 [百度学术]
赵江林，江兰，钟灵允，谭茂玲，赵钢. 荞麦立枯病病原菌的分离与鉴定//中国植物病理学会. 中国植物病理学会2018 年学术年会论文集. 北京：中国农业科学技术出版社， 2018： 33 [百度学术]
Zhao J L， Jiang L， Zhong L Y， Tan M L， Zhao G. Isolation and identification of pathogenic bacteria from buckwheat blight.// Chinese Society for Plant Pathology. Proceedings of the 2018 annual conference of chinese society for plant pathology. Beijing： China Agricultural Sciences and Technology Press， 2018： 33 [百度学术]
李光胜，卢翔，刘洋，张凯旋，王海华，唐新科，周美亮. 苦荞FtEIN3基因的克隆及其抗立枯病功能分析. 植物遗传资源学报， 2023， 24（5）： 1389-1400 [百度学术]
Li G S， Lu X， Liu Y， Zhang K X， Wang H H， Tang X K， Zhou M L. Cloning and functional analysis of the FtEIN3 gene in tartary buckwheat against bacterial blight. Journal of Plant Genetic Resources， 2023， 24（5）： 1389-1400 [百度学术]
李淼， 卢瑞芳. 提高荞麦的抗病性. 国外农学-杂粮作物， 1992（5）： 46-49 [百度学术]
Li M， Lu R F. Enhance the disease resistance of buckwheat. Foreign Agriculture-Minor Cereal Crops， 1992（5）： 46-49 [百度学术]
Alexander R D， Wendelboe-Nelson C， Morris P C. The barley transcription factor HvMYB1 is a positive regulator of drought tolerance. Plant Physioloigy and Biochemistry， 2019， 9（142）： 246-253 [百度学术]
Saavedra G M， Sanfuentes E， Figueroa P M， Figueroa C R. Independent preharvest applications of methyl jasmonate and chitosan elicit differential upregulation of defense-related genes with reduced incidence of gray mold decay during postharvest storage of fragaria chiloensis fruit. International Journal of Molecular Sciences， 2017， 18（7）： 1420 [百度学术]
Qi G， Chen J， Chang M， Chen H， Hall K， Korin J， Liu F， Wang D， Fu Z Q. Pandemonium breaks out： Disruption of salicylic acid-mediated defense by plant pathogens. Molecular Plant， 2018， 11（12）： 1427-1439 [百度学术]
Malamy J， Carr J P， Klessig D F， Raskin I. Salicylic Acid： A likely endogenous signal in the resistance response of tobacco to viral infection. Science， 1990， 250（4983）： 1002-1004 [百度学术]
He Y Q， Zhang K X， Li S J， Lu X， Zhao H， Guan C N， Huang X， Shi Y L， Kang Z， Fan Y， Li W， Chen C， Li G S， Long O， Chen YY， Hu M， Cheng J P， Xu B L， Mark A Chapman， Milen I Georgiev， Alisdair R Fernie， Zhou M L. Multiomics analysis reveals the molecular mechanisms underlying virulence in Rhizoctonia and jasmonic acid-mediated resistance in tartary buckwheat（Fagopyrum tataricum）. Plant Cell， 2023， 35（8）： 2773-2798 [百度学术]
Zhang Z， Jiang C， Chen C， Su K， Lin H， Zhao Y， Guo Y. VvWRKY5 enhances white rot resistance in grape by promoting the jasmonic acid pathway. Horticulture Research， 2023， 10（10）： 172 [百度学术]
Yu Y H， Jiao Z L， Bian L， Wan Y T， Yu K K， Zhang G H， Guo D L.Overexpression of vitis vinifera VvbZIP60 enhances Arabidopsis thaliana resistance to powdery mildew via the salicylic acid signaling pathway. Scientia Horticulturae， 2019， 10（256）： 108640 [百度学术]
Hunjan M S， Kumar S， Lore J S， Cruz C M V. Efficiency of different rhizoctonia solani inoculum source against sheath blight screening in rice under field conditions. Tropical Plant Pathology， 2022， 47（2）： 309-313 [百度学术]
Kotba I， Achouri M， Benbouazza A， Achbani E H. Morphological， pathogenic and molecular characterisation of rhizoctonia solani strains isolated from potato. Scienc Edomain International， 2018， 11（4）： 1-16 [百度学术]
徐琴琴， 陈卫良， 毛碧增. 立枯丝核菌毒素的研究进展. 核农学报， 2020， 34（10）： 7 [百度学术]
Xu Q Q， Chen W L， Mao B Z. Research progresses in phytotoxin produced by Rhizoctonia solani. Journal of Nuclear Agriculture， 2020， 34（10）： 7 [百度学术]
Rodrigo I， Vera P， Conejero V. Degradation of tomato pathogenesis-related proteins by an endogenous 370 kDa aspartyl endoproteinase. European Journal of Biochemistry， 1989， 184（3）： 663-669 [百度学术]
Rodrigo I， Vera P， Van Loon L C， Conejero V. Degradation of tobacco pathogenesis-related proteins： Evidence for conserved mechanisms of degradation of pathogenesis-related proteins in plants. Plant Physiology， 1991， 95（2）： 616-622 [百度学术]
Xia Y J， Suzuki H， Borevitz J， Blount J， Guo Z J， Patel K， Dixon R A， Lamb C. An extracellular aspartic protease functions in Arabidopsis thaliana disease resistance signaling. The EMBO Journal， 2014， 23（4）： 980-988 [百度学术]
Qiu D， Xiao J， Ding X， Xiong M， Cai M， Cao Y， Li X， Xu C， Wang S. OsWRKY13 mediates rice disease resistance by regulating defense-related genes in salicylate and jasmonate-dependent signaling. Molecular Plant-microbe Interactions， 2007， 20（5）： 492-499 [百度学术]
Yang Z， Huang Y， Yang J， Yao S， Zhao K， Wang D， Qin Q， Bian Z， Li Y， Lan Y， Zhou T， Wang H， Liu C， Wang W， Qi Y， Xu Z， Li Y. Jasmonate signaling enhances RNA silencing and antiviral defense in rice. Cell Host & Microbe， 2020， 28（1）： 89-103 [百度学术]
Ma W， Pang Z， Huang X， Xu J， Pandey S S， Li J， Achor D S， Vasconcelos F N C， Hendrich C， Huang Y， Wang W， Lee D， Stanton D， Wang N. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications， 2022， 13（1）： 1-13 [百度学术]
刘银萍. '洛阳红'花期花瓣抗氧化酶SOD，POD和CAT活性的研究. 河南林业科技， 2020， 40（3）：13-15， 41 [百度学术]
Liu Y P. The study of antioxidants of 'Luoyanghong' on petals about SOD、POD、CAT during florescences. Henan Forestry Science and Technology， 2020， 40（3）： 13-15， 41 [百度学术]
李易初， 石凤梅， 马立功， 刘佳，孟庆林. 核盘菌菌丝内POD和SOD活性与其对大豆致病力关系初探. 黑龙江八一农垦大学学报， 2021， 33（1）： 1-6， 14 [百度学术]
Li Y C， Shi F M， Ma L G， Liu J，Meng Q L. The relationship between POD and SOD activities of nuclear and its pathogenicity to soybean. Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural Reclamation University， 2021， 33（1）： 1-6， 14 [百度学术]
Pilarska M， Skowron E， Pietraś R， Krupinska K， Niewiadomska E. Changes in lipid peroxidation in stay-green leaves of tobacco with senescence-induced synthesis of cytokinins. Plant Physiology and Biochemistry， 2017， 9（118）： 161-167 [百度学术]
Li J， Feng L， Li D， Liu X L， Pan Y Y， He J， Zhang J X. ROS regulate NCF2， key metabolic enzymes and MDA levels to affect the growth of fusarium solani. Agriculture， 2022， 12（11）： 1840 [百度学术]