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基于SCoT标记的黑稻种质资源遗传多样性分析  PDF

  • 刘柯忻 1 ✉
  • 张晓娟 1 ✉
  • 张卫平 1
  • 李新生 1
  • 吴升华 2
  • 马秀奇 1
1. 陕西理工大学生物科学与工程学院，汉中 723001； 2. 汉中市农业技术推广与培训中心，陕西汉中 723000

最近更新：2025-01-23

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.5-20240412001

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摘要

黑稻种质资源分布广泛，遗传背景较为复杂，揭示黑稻材料的遗传背景、明确材料间的亲缘关系具有重要意义。本研究利用实验室前期筛选的30条SCoT引物对90份水稻材料（包括21份黑叶黑稻、24份紫叶黑稻、30份绿叶黑稻、15份白稻）进行遗传多样性分析。结果显示，SCoT引物共扩增出194个条带，其中多态性条带165条，多态性比例为85%。等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei′s基因多样性指数（H）以及Shannon′s信息指数（I）的平均值分别为1.9216、1.3922、0.2445和0.3836。聚类分析结果显示，在遗传相似系数为0.73处，将90份水稻材料分为4类。群体结构分析与聚类分析结果一致性较好，说明SCoT标记适用于黑稻遗传背景及亲缘关系的研究。供试水稻种质间的遗传相似系数主要分布在0.59~0.79之间，遗传相似度较高，分子方差分析显示，91%遗传变异来源于群体内，群体间的遗传变异为9%，说明供试水稻材料间遗传差异较小，应进一步丰富黑稻种质资源遗传多样性。本研究为黑稻杂交育种中的亲本选择提供参考依据，同时为黑稻品种的遗传改良、新品种培育提供理论依据。

水稻是全球最重要的粮食作物之一，世界上半数以上的人口以水稻为主食［

1］。我国有色稻种质资源非常丰富，主要包括黑米、红米、紫米、绿米和黄米等［2］。与白米相比，黑米具有极高的食用和药用价值。黑米含有较高的蛋白质、植物脂肪、维生素、矿物质、膳食纤维等营养物质［3］，同时，还含有丰富的花青苷。黑米花青苷主要组分有矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3，5-二葡萄糖苷、矢车菊素-3-鼠李糖苷等［4］。黑米花青苷具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、调节糖类脂类代谢、调节肠道菌群等作用［5］，有益于人体健康。水稻中存在大量的黑叶稻资源，其叶片颜色为黑色、紫色，富含花青苷类物质。黑叶稻“黑冠”是由汉中市农科所吴升华老师培育的黑稻新品种，其叶片自苗期到成熟期均为黑色。本课题组前期研究表明，“黑冠”叶片中花青苷（矢车菊素-3-O-葡萄糖苷）含量比较高，约为0.7%~0.9%，具有重要的开发利用价值。

陕西汉中是我国黑稻原产地之一，黑稻的栽培和研究历史悠久，选育的黑稻品种有“汉中黑糯”“黑丰糯”“黑帅”等，在国内广泛种植［

6］。黑稻杂交育种实践表明，亲本之间适宜的遗传差异，有利于提高杂交水稻的质量和产量。因此，黑稻种质资源的遗传多样性分析及遗传背景研究是黑稻杂交育种的前提和基础，为黑稻品种选育中的杂交亲本选择提供参考依据，也为黑稻种质资源的保护和利用、遗传改良提供了理论基础。

种质资源遗传多样性研究方法主要包括形态学标记、细胞学标记、生理生化标记及分子标记［

7］。相对于其他标记，分子标记技术直接以DNA序列特异性为依据，具有多态性高、稳定性好、可靠性强的特点，能真实准确地反映材料间的遗传差异［8］。目前，广泛应用的DNA分子标记技术主要有SRAP、SCoT（Start codon targeted polymorphism）、SSR、SNP等。SCoT标记，即目标起始密码子多态性标记，是由Collard等［9］等开发的一种新型分子标记技术，其原理是基于植物DNA翻译起始密码子ATG侧翼区域的保守性，设计引物对不同样本DNA进行PCR扩增。引物设计时，起始密码子ATG（+1，+2和+3）、及附近的G（+4）、A（+7）、C（+8）、C（+9）固定不变，其他位置核苷酸序列可自由填充。与RAPD、ISSR分子标记相比，SCoT分子标记作为一种建立在PCR基础上的单引物扩增技术，具有引物设计简单、通用性强、操作便捷及多态性高、重复性好等优点，适合于生物多样性分析、遗传图谱构建及重要性状标记等方面研究［10］。

目前，SCoT标记技术已应用于花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）［

11］、猕猴桃（Actinidia chinensis Planch.）［12］、金线莲［Anoectochilus roxburghii （Wall.） Lindl.］［13］、黄桃（Prunus persica L.）［14］、甘薯［Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill］［15］、朱顶红［Hippeastrum rutilum （Ker-Gawl.） Herb.］［16］等植物的遗传多样性分析，但在水稻中的研究报道较少。Collard等［9］利用36条SCoT引物对10份白稻进行遗传多样性分析，结果表明，SCoT引物对白稻基因型的聚类与已知的分类和系谱信息一致；Mollier等［17］利用25条SCoT引物对8份白稻进行遗传多样性分析得出，22条引物表现出多态性，在遗传相似系数0.48处，将8份白稻聚为2类。SCoT标记技术在黑稻中的研究未见报道。本研究以90份水稻材料为研究对象，通过SCoT分子标记开展遗传多样性分析，旨在明确供试水稻材料间的亲缘关系，揭示材料的遗传背景，从而为黑稻遗传育种工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

90份水稻材料均由汉中市农科所吴升华老师提供，包括21份黑叶黑稻、24份紫叶黑稻、30份绿叶黑稻、15份白稻，材料基本信息见表1。材料于2023年3月底种植于汉中市农业科学研究所试验田，种植小区长×宽为100 cm×100 cm，每个小区播种1份种质，每个种质播种200粒催芽处理的水稻种子，种植10行，行长100 cm，行距10 cm，株距5 cm。2023年4月20日采集水稻幼嫩叶片，保存于-80 ℃冰箱备用。

表1  试验材料名称及类型
Table 1  The name and type of the test materials
编号Code名称Name类型Type编号Code名称Name类型Type
1 黑冠 黑叶黑稻 46 黑帅ck 绿叶黑稻
2 黑叶稻1 黑叶黑稻 47 78紫香糯737-13 绿叶黑稻
3 紫叶稻1 黑叶黑稻 48 79紫香糯737-3 绿叶黑稻
4 紫糯 黑叶黑稻 49 80（17）隆黑帅-2-2-4 绿叶黑稻
5 海南半紫叶稻 黑叶黑稻 50 88云南S/制西F1 绿叶黑稻
6 25黑叶稻♂ 黑叶黑稻 51 90冠S/451黑BF1 绿叶黑稻
7 28谷A/黑冠F1 紫叶黑稻 52 94云南黑谷-1-1-101 绿叶黑稻
8 29黑冠♂ 黑叶黑稻 53 961316黑S/制西-1 绿叶黑稻
9 30谷A/紫黑F1 紫叶黑稻 54 105黑糯-1-1 绿叶黑稻
10 31紫叶黑变♂ 黑叶黑稻 55 118紫香糯737-9 绿叶黑稻
11 4522-WB1766 黑叶黑稻 56 125云南黑谷-1-1-1 绿叶黑稻
12 4622-WB1767 黑叶黑稻 57 154（17）隆黑帅-2-2-5 绿叶黑稻
13 4722P840 黑叶黑稻 58 157 WGRS70黑帅-18-2 绿叶黑稻
14 4822P853 黑叶黑稻 59 162（17）长黑-1-1-2-1 绿叶黑稻
15 5022P867 黑叶黑稻 60 166（13）Y黑矮-1-1 绿叶黑稻
16 56黑寸谷 黑叶黑稻 61 174（13）Y黑矮-3-1-1 绿叶黑稻
17 57紫叶黑变-5-1-1 黑叶黑稻 62 233东北黑米 绿叶黑稻
18 62紫壳黑粳 紫叶黑稻 63 271（13）Y黑-2-5-6S 绿叶黑稻
19 70湛江黑叶稻 黑叶黑稻 64 274（13）Y黑-2-5-9S 绿叶黑稻
20 73培811黑-1-1-1-4 紫叶黑稻 65 278（13）Y黑-7-1-1-1S 绿叶黑稻
21 75WGRS70黑帅-1-10 紫叶黑稻 66 279（13）Y黑-7-1-1-2S 绿叶黑稻
22 81 WGRS70黑帅-9-1 紫叶黑稻 67 280（13）Y黑-7-1-1-3S 绿叶黑稻
23 84谷丰A/黑帅F1 紫叶黑稻 68 285（13）Y黑-7-1-1-4S 绿叶黑稻
24 86谷丰A/黑优占F1 紫叶黑稻 69 288（13）Y黑-7-1-1-7S 绿叶黑稻
25 87黑优占♂ 紫叶黑稻 70 291（13）Y黑-7-1-1-11S 绿叶黑稻
26 93（18）106黑香-1-103 紫叶黑稻 71 293（13）Y黑-7-1-1-13S 绿叶黑稻
27 103洋黑3号-1 紫叶黑稻 72 299（13）Y黑-2-3S 绿叶黑稻
28 108泰国黑米-1-1 紫叶黑稻 73 302（13）Y黑-2-7S 绿叶黑稻
29 109黑砻谷 紫叶黑稻 74 303（13）Y黑-7-2-1S 绿叶黑稻
30 110451黑B-1-2 紫叶黑稻 75 707（13）Y黑-2-1-2-1-1-1 绿叶黑稻
31 111培811黑-1-1-2-1 紫叶黑稻 76 黄华占ck 绿叶白稻
32 124矮黑-1-1 紫叶黑稻 77 34冠S/紫叶稻F1 绿叶白稻
33 128培811黑-1-1-1-1 紫叶黑稻 78 36昌A/紫叶稻F1 绿叶白稻
34 147培811黑-1-1-8-1 紫叶黑稻 79 305冠S 绿叶白稻
35 159黑优占ck 紫叶黑稻 80 749韶香100 绿叶白稻
36 182 WGRS70黑帅-1-1 紫叶黑稻 81 635重大粒 绿叶白稻
37 192 WGRS70黑帅-2-1 紫叶黑稻 82 602 绿叶白稻
38 208 WGRS70黑帅-16-1 紫叶黑稻 83 603 绿叶白稻
39 222紫香糯737 紫叶黑稻 84 607 绿叶白稻
40 22422-WB-1770 黑叶黑稻 85 601 绿叶白稻
41 25422P1089 黑叶黑稻 86 605 绿叶白稻
42 296（19）黑帅-2S 紫叶黑稻 87 609 绿叶白稻
43 307黑冠S 黑叶黑稻 88 634黄叶稻 黄叶白稻
44 44早黑冠 黑叶黑稻 89 紫叶稻2 紫叶白稻
45 720早黑一号 黑叶黑稻 90 35紫叶稻♂ 紫叶白稻

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取与检测

采用植物基因组DNA提取试剂盒（北京庄盟国际生物基因科技有限公司），提取水稻基因组DNA。用1%的琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop微量分光光度计（赛默飞世尔科技有限公司，上海）检测DNA质量和浓度，将DNA稀释至100 ng/uL，保存于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 PCR扩增

使用Primer 3软件（https：//primer3.org/）设计引物，由奥科鼎盛生物科技有限公司（北京）合成，引物序列见表2。以90份水稻材料基因组DNA为模板，利用30个SCoT引物进行PCR扩增。PCR总反应体系为10 μL，其中2×Taq Master Mix（苏州近岸蛋白质科技股份有限公司） 5 μL，ddH2O 3 μL，10 μmol/L SCoT引物1 μL，100 ng/uL DNA模板1 μL。PCR扩增程序为94 ℃预变性4 min； 94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，10个循环；94 ℃变性30 s，35 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

表2  SCoT引物序列
Table 2  The sequence of primers

引物编号

Primer code

序列（5′-3′）

Sequence（5′-3′）

引物编号

Primer code

序列（5′-3′）

Sequence（5′-3′）

SCoT1 CAACAATGGCTACCACCA SCoT20 ACCATGGCTACCACCGCG
SCoT2 CAACAATGGCTACCACCC SCoT21 ACGACATGGCGACCCACA
SCoT3 CAACAATGGCTACCACCG SCoT22 AACCATGGCTACCACCAC
SCoT4 CAACAATGGCTACCACCT SCoT23 CACCATGGCTACCACCAG
SCoT6 CAACAATGGCTACCACGC SCoT25 ACCATGGCTACCACCGGG
SCoT9 CAACAATGGCTACCAGCA SCoT26 ACCATGGCTACCACCGTC
SCoT11 AAGCAATGGCTACCACCA SCoT27 ACCATGGCTACCACCGTG
SCoT12 ACGACATGGCGACCAACG SCoT29 CCATGGCTACCACCGGCC
SCoT13 ACGACATGGCGACCATCG SCoT30 CCATGGCTACCACCGGCG
SCoT14 ACGACATGGCGACCACGC SCoT31 CCATGGCTACCACCGCCT
SCoT15 ACGACATGGCGACCGCGA SCoT32 CCATGGCTACCACCGCAC
SCoT16 ACCATGGCTACCACCGAC SCoT33 CCATGGCTACCACCGCAG
SCoT17 ACCATGGCTACCACCGAG SCoT34 ACCATGGCTACCACCGCA
SCoT18 ACCATGGCTACCACCGCC SCoT35 CATGGCTACCACCGGCCC
SCoT19 ACCATGGCTACCACCGGC SCoT36 GCAACAATGGCTACCACC

使用红色字体标注SCoT引物中不变碱基位点

The invariant base sites in the SCoT primers are marked in red

1.2.3 凝胶电泳检测

PCR产物采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电压设置为150 V，电泳时间为2 h。电泳结束后，将凝胶置于0.2% AgNO3染色液中摇床染色5 min，蒸馏水洗涤3次，每次30 s，加入显色液，摇床显色直至条带清晰，拍照。

1.2.4 数据统计

统计聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱中的清晰条带，在相同迁移位置上，有条带记为“1”，无条带记为“0”，用Excel构建0-1矩阵。利用Popgene 1.32软件（http：//www.ualberta.ca/%7Efyeh/Pop32.exe）计算多态性信息含量（PIC，polymorphism information content）、等位基因数（Na，number of alleles）、有效等位基因数（Ne，number of effective alleles）、Nei′s基因多样性指数（H，Nei′s gene diversity index）、Shannon′s信息指数（I，Shannon's information index）。利用NTSYS-pc2.10e软件（https：//appliedbiostat.com/ntsyspc/downloads/ntinst 21.exe）进行聚类分析，构建聚类分析图。主成分分析使用NTSYS-pc2.10e软件（https：//appliedbiostat.com/ntsyspc/downloads/ntinst21.exe）中的Dcenter和Eigen程序进行。运用Structure软件（https：//web.stanford.edu/ group/pritchardlab/structure_software/release_versions/v2.3.4/html/structure.html）进行群体结构分析。运用Arlequin 3.5.2.2软件（https：//cmpg.unibe.ch/software/arlequin35/Arl35Downloads.html）进行分子方差分析。

2 结果与分析

2.1 SCoT引物扩增结果

SCoT引物对供试水稻材料扩增的电泳图谱条带清晰，结果稳定（图1）。30个SCoT引物在90份水稻材料中共扩增出194个条带（表3），其中多态性条带165个，多态性比例约为85%，有8个SCoT引物的多态性条带比例达到100%。说明SCoT引物多态性高，适合于水稻遗传背景和亲缘关系的研究，同时也表明水稻材料间存在明显的遗传差异。30个SCoT引物的扩增条带数在4~11之间，其中扩增条带数最多的是SCoT1；扩增条带数最少的是SCoT19和SCoT35。30个SCoT引物的多态性信息含量在0.60~0.87之间，平均值为0.76；等位基因数在1.6667~2.0000之间，平均值为1.9216；有效等位基因数在1.1214~1.6731之间，平均值为1.3922；Nei′s基因多样性指数在0.1004~0.3632之间，平均值为0.2445；Shannon′s信息指数在0.1937~0.5396之间，平均值为0.3836。

图1  SCoT17在部分水稻材料中扩增的电泳图谱

Fig. 1  Electrophoretogram amplified by SCoT17 in partial rice materials

M：DNA marker III；1~57：材料编号同表1，下同；黑色箭头表示多态性条带

1-57： The material numbers are the same as those in table 1， the same as below； Black arrows represent polymorphic bands

表3  SCoT引物对90份水稻材料的扩增结果
Table 3  The amplified results of 90 rice materials with SCoT primers

引物编号

Primer code

总条带数

Total bands

多态性条带数

Polymorphic bands

多态性比例（%）

Polymorphism

ratio

多态性信息含量

PIC

等位基因数

Na

有效等位基因数

Ne

Nei′s基因多样性指数

H

Shannon′s信息指数

I

SCoT1 11 10 90.90 0.87 1.9091 1.3557 0.2266 0.3642
SCoT2 5 4 80.00 0.69 1.8000 1.2474 0.1718 0.2854
SCoT3 7 7 100 0.63 2.0000 1.2809 0.1988 0.3356
SCoT4 5 4 80.00 0.74 1.8000 1.4054 0.2445 0.3721
SCoT6 8 6 75.00 0.78 2.0000 1.4025 0.2470 0.3842
SCoT9 5 4 80.00 0.60 1.8000 1.3609 0.2363 0.3731
SCoT11 5 5 100 0.74 2.0000 1.4257 0.2931 0.4666
SCoT12 6 6 100 0.80 2.0000 1.4524 0.2632 0.4050
SCoT13 6 6 100 0.76 2.0000 1.2409 0.1731 0.3005
SCoT14 6 5 83.33 0.76 2.0000 1.4553 0.2768 0.4303
SCoT15 6 5 83.33 0.77 1.8333 1.1795 0.1168 0.2017
SCoT16 6 4 66.70 0.79 1.6667 1.3858 0.2183 0.3231
SCoT17 7 6 85.71 0.81 2.0000 1.5167 0.3071 0.4679
SCoT18 7 7 100 0.81 2.0000 1.3474 0.2429 0.3999
SCoT19 4 3 75.00 0.70 2.0000 1.1214 0.1004 0.1937
SCoT20 7 5 71.43 0.81 1.7143 1.3717 0.2332 0.3579
SCoT21 9 7 77.78 0.85 1.8889 1.2491 0.1640 0.2703
SCoT22 5 5 100 0.64 2.0000 1.3307 0.2118 0.3497
SCoT23 8 6 75.00 0.83 2.0000 1.4708 0.2890 0.4493
SCoT25 7 6 85.71 0.83 2.0000 1.4415 0.2738 0.4206
SCoT26 8 7 87.50 0.80 1.8750 1.4709 0.2840 0.4329
SCoT27 7 7 100 0.82 2.0000 1.6731 0.3630 0.5297
SCoT29 6 5 83.33 0.72 1.8333 1.3509 0.2354 0.3761
SCoT30 5 4 80.00 0.73 2.0000 1.4524 0.2894 0.4555
SCoT31 6 5 83.33 0.79 2.0000 1.6191 0.3632 0.5396
SCoT32 6 5 83.33 0.76 2.0000 1.4679 0.2840 0.4425
SCoT33 9 7 77.78 0.84 1.7778 1.5108 0.2838 0.4172
SCoT34 8 6 75.00 0.82 1.7500 1.3762 0.2321 0.3592
SCoT35 4 3 75.00 0.64 2.0000 1.2808 0.1872 0.3039
SCoT36 5 5 100 0.69 2.0000 1.5229 0.3255 0.4996
平均 Mean 85.00 0.76 1.9216 1.3922 0.2445 0.3836

PIC： Polymorphism information content； Na： Number of alleles； Ne： Number of effective alleles； H： Nei's gene diversity index； I： Shannon's information index

2.2 遗传相似系数分布

SCoT标记分析得出，供试90份水稻材料间遗传相似系数在0.37~0.97之间，平均值为0.67。其中，材料4（紫糯）和材料70［291（13）Y黑-7-1-1-11S）的遗传相似系数最小；材料72（299（13）Y黑-2-3S］和材料73［302（13）Y黑-2-7S］的遗传相似系数最大。

对供试水稻材料间的两两遗传相似系数共计4005个数值的次数分布分析（图2），发现供试材料遗传相似系数主要分布在0.59~0.79之间，占比81.97%。遗传相似系数在0.73处时，频次最高。遗传相似系数小于0.73的有2462个，占比61.47%；遗传相似系数大于等于0.73的有1543个，占比38.53%。

图2  供试水稻材料间遗传相似系数分布

Fig. 2  Distribution of genetic similarity coefficients among the tested rice materials

2.3 聚类分析

SCoT标记构建的聚类图显示，90份水稻材料的遗传相似系数介于0.50~0.97，均值为0.74。在遗传相似系数为0.73处，将90份水稻材料分为4类（图3）。第I类包括材料1（黑冠）、材料16（56黑寸谷）、材料19（70湛江黑叶稻）等5份黑叶黑稻材料。第II类包括25份材料，其中有21份黑叶、紫叶黑稻材料、2份绿叶黑稻材料及2份白稻材料。第III类包括37份材料，其中有25份绿叶黑稻材料、7份紫叶黑稻材料及5份白稻材料。其余23份材料较为分散，没有明显的特征聚为第IV类，其中有6份黑叶黑稻材料、6份紫叶黑稻材料、3份绿叶黑稻材料及8份白稻材料。聚类图中除第IV类外，第I、II、III类能较好地区分绿叶黑稻和黑叶黑稻，同时，绿叶稻和黑叶、紫叶稻也能区分开。在聚类图中，亲缘关系较近的材料如材料10（31紫叶黑变♂）与材料17（57紫叶黑变-5-1-1），材料72［299（13）Y黑-2-3S］、材料73［302（13）Y黑-2-7S］与材料75［707（13）Y黑-2-1-2-1-1-1］，材料85（601）与材料86（605）聚在一起。说明SCoT标记能准确反映水稻材料的亲缘关系及类型。

图3  SCoT标记构建的90份水稻材料的聚类图

Fig. 3  Cluster dendrogram of 90 rice materials constructed by SCoT markers

2.4 主成分分析

主成分分析结果显示，第1主成分和第2主成分分别占总变异的11.98%和7.96%（图4）。90份水稻材料分为3种类型，其中，除材料46（黑帅ck）、材料54（105黑糯-1-1）和材料62（233东北黑米）外，其他绿叶黑稻材料及多数白稻材料聚为一类（PI）。大多数紫叶黑稻材料及少数的黑叶黑稻材料聚为一类（PII），其余黑叶黑稻材料聚为一类（PIII）。主成分分析将绿叶黑稻与黑叶黑稻区分开，与按叶色表型进行分类相符，从分子水平揭示了绿叶黑稻与黑叶黑稻之间的遗传差异，表明SCoT标记适合于黑稻种质资源遗传多样性分析。

图4  90份水稻材料的主成分分析

Fig. 4  Principal component analysis of 90 rice materials

2.5 群体结构分析

Structure分析显示，当K=3时，ΔK值最大，表明90份水稻材料聚为3类较为合适（图5）。第I类（GⅠ）包括33份材料，第II类（GⅡ）包括15份材料，在45份黑叶、紫叶黑稻材料中，有36份黑叶、紫叶黑稻材料划分在第I类和第II类。第III类（GIII）包括42份材料，在30份绿叶黑稻材料中，有26份绿叶黑稻材料划分在第III类。群体结构分析能较好地将绿叶黑稻与黑叶黑稻、紫叶黑稻区分开。说明SCoT分子标记技术作为新型分子标记技术用于水稻种质资源遗传多样性分析及种质鉴定准确、可靠。综上所述，群体结构分析结果与聚类分析结果具有较高一致性。

图5  SCoT标记构建的90份水稻材料的群体结构分析

Fig. 5  Population structure analysis of 90 rice materials constructed by SCoT markers

A：利用lnP（D）得到的ΔK变化曲线；B：90份水稻材料的群体结构分析；红色：GI类；绿色：GII类；蓝色：GIII类；X轴上的竖栏代表样本；不同颜色的比例代表基因型属于对应类型的概率

A： ΔK curve obtained by lnP（D）； B： Population structure analysis of 90 rice materials； Red： Class GI； Green： Class GII； Blue： Class GIII； Vertical columns on the X-axis represent each sample； The proportion of each color represents the probability that the genotype belongs to each class

2.6 分子方差分析

将90份水稻材料分为3个群体，即黑叶黑稻和紫叶黑稻（45份）、绿叶黑稻（30份）、白稻（15份）进行分子方差分析。结果表明（表4），3个水稻群体的遗传变异主要存在于群体内部，群体内变异占总变异的91%，群体间的遗传变异仅占总变异的9%。

表4  分子方差分析
Table 4  Analysis of molecular variance

变异来源

Source of variation

自由度

df

总方差

Sum of squares

方差分量

Variance components

方差分量比例（%）

Percentage of variation

群体间Among populations 2 166.84 2.2 9
群体内Within populations 87 1987.24 22.84 91
总计Total 89 2154.09 25.04 100

固定指数Fst：0.09

Fixation index Fst：0.09

3 讨论

水稻种质资源的遗传背景及亲缘关系分析是水稻遗传育种的首要任务，可为杂交育种中合理选择亲本、培育优质水稻提供理论依据。目前，在水稻遗传多样性研究上主要使用的分子标记技术为SSR标记。Deepika等［

18］利用25对SSR引物对31份水稻地方品种进行遗传多样性分析，均表现出多态性，多态性信息含量在0.12~0.66之间，在遗传相似系数0.68处，将31份水稻地方品种聚为10类；Kalita等［19］利用28对SSR引物对27份地方水稻种质进行遗传多样性分析，有17个表现出多态性，多态性信息含量在0.076~0.499之间，系统发育树将27个基因型分为3个类群。

SCoT分子标记为单引物标记，具有通用性好、操作方便、多态性高及重复性好等特点［

20］。与SSR标记技术相比，SCoT标记技术在多态性条带数、多态性比例、标记指数等方面更具优势［21］。本研究利用30条SCoT引物对黑稻材料进行遗传多样性分析，SCoT引物的多态性比例为85%，多态性信息含量为均值0.76，高于SSR标记，说明SCoT引物多态性丰富，适合进行黑稻遗传多样性分析。

聚类分析结果显示，在遗传相似系数0.73处，将90份水稻材料分为4类。大部分黑叶、紫叶黑稻材料划分在第I、II类，大部分绿叶黑稻材料及少量白稻材料划分在第III类。结果表明，黑叶、紫叶黑稻材料能够与白稻材料较好地区分开，符合传统的系谱分类；绿叶黑稻与黑叶、紫叶黑稻之间的亲缘关系较远。根据本研究的聚类结果，在水稻杂交育种实践中，亲本应尽可能选择亲缘关系较远、遗传差异大的材料，如选择黑叶黑稻中的材料4（紫糯）和绿叶黑稻中的材料70［291（13）Y黑-7-1-1-11S］、紫叶黑稻中的材料39（222紫香糯737）和绿叶黑稻中的材料56（125云南黑谷-1-1-1）进行杂交。避免选择亲缘关系近也就是遗传相似系数较大的材料。

此外，选择不同类型的水稻材料进行杂交，有利于丰富黑稻种质资源的遗传多样性。例如，选择黑叶稻（叶片颜色为黑色的水稻）和黑米稻（米粒颜色为黑色的水稻）杂交有利于丰富黑米稻或黑叶稻的遗传基础，为选育黑叶杂交稻或黑米杂交稻提供遗传差异较大的杂交稻亲本，有利于培育出多种类型的黑米稻和黑叶稻新品种。现有的黑叶黑稻和绿叶黑稻的资源数量及类型有限，不利于培育高产抗病的黑米杂交稻和黑叶杂交稻，因此，可选择遗传资源十分丰富的白米水稻与黑米、黑叶稻品种杂交以培育出与现有黑稻或黑叶稻遗传差异显著的杂交黑稻恢复系、优良的新型种质资源及新品种。此外，还可开展黑叶稻和黑米稻籼与粳的亚种间杂交以丰富黑米稻或黑叶稻的遗传基础。分子方差分析结果显示，总遗传变异的91%来自群体内，9%来自于群体间，表明供试水稻材料的遗传变异主要来自群体内，群体间的遗传变异较小，但也说明群体间即黑叶黑稻和紫叶黑稻、绿叶黑稻、白稻之间存在一定的遗传变异。因此，在未来的育种中，可通过水稻不同群体之间的杂交实现群体间的基因交流，从而对黑稻的杂交育种发挥积极的作用。

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