摘要
工业大麻（Cannabis sativa L.）是一种应用在造纸、医疗保健、纺织等领域的高价值经济作物。创制工业大麻新种质是开展品种选育和功能基因组研究的重要基础。本研究利用甲基磺酸乙酯（EMS）构建了中大麻资4号的突变体群体。通过设置8个EMS诱变剂浓度梯度处理，明确了0.8% EMS处理浓度对中大麻资4号诱变效果最好。对2000粒中大麻资4号种子进行诱变后，M1共成苗644株，萌发率为32.2%，其中包括叶色、花序和株高变异单株90株，突变率为13.98%。对M1突变体进行大麻二酚含量测定，获得3个高大麻二酚和2个低大麻二酚含量突变株；通过测序发现大麻二酚含量突变体中5个大麻素关键催化酶基因（CsPT4、CsOAC1、CsOLS1、CsCBDAS和CsTHCA）及其启动子区域DNA序列均未发生突变，但是大麻二酚含量突变体中以上5个催化酶基因的表达水平较对照出现显著变化。由此推断，EMS处理导致了突变体中影响大麻二酚代谢途径的调控基因突变进而调控大麻二酚合成途径催化酶的表达，最终表现为突变体花头中大麻二酚含量显著变化。本研究通过创制EMS突变体群体为工业大麻育种提供了优异种质资源，也为进一步解析大麻素合成代谢途径的调控机制及挖掘相关基因提供良好材料和基础。
大麻（Cannabis sativa L.）又称火麻，是我国传统的纤维植物和药用植物，属于大麻科（Cannabinaceae） 大麻属（Cannabis）一年生草本植
相比于欧美等国工业大麻主栽品种，我国主栽品种大麻二酚含量有待提
本研究通过EMS诱变中国农业科学院麻类研究所培育品种中大麻资4号（皖品鉴登记字第2009001），构建了一个工业大麻突变体群体并分析突变群体的表型变异特点。通过筛选大麻二酚含量变异突变体，进一步分析突变体中大麻素代谢途径中5个关键催化酶基因CBDAS、THCAS、CsPT4、CsOAC1和CsOLS1的DNA序列及表达水
本研究选用中大麻资4号（皖品鉴登记字第2009001）为诱变材料，该材料来自中国农业科学院麻类研究所。此品种为雌雄异株品种，生育时期分为出苗期、现蕾期、开花期、种子成熟期；全生育期为152 d，花叶成熟期为136 d，平均株高3.14 m，花叶产量2556～2717 kg/h
将EMS溶液加入磷酸缓冲液（浓度为1.2 g/mL）配置7个诱变剂浓度：0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2%（不含EMS的磷酸缓冲液为对照）。不同浓度梯度的EMS溶液中均放入健康饱满的中大麻资4号种子各150粒，并保持200 r/min震荡13 h。震荡结束后用Na2S2O3（0.2 mol/L）中和EMS溶液，并使用蒸馏水冲洗种子3次后于阴凉处晒干。于7 d、10 d和14 d分别计算种子萌发率（发芽数量占种子总量的百分比）。EMS处理常以植物种子半致死（LD50）浓度为
本研究中的中大麻资4号的最佳EMS浓度为0.8%。挑选健康饱满种子2000粒进行0.8% EMS诱变处理13 h后，使用蒸馏水冲洗种子3次后于阴凉处晒干。于2021年5月20日在吉林省延边市犇福农场小区进行诱变后种子播种，选择平整小区4个，每个小区面积为80
吉林省延边市犇福农场小区播种的诱变后种子出苗2个月后通过扦插方式对M1代所有植株在温室花盆中进行扩繁与保存，每个植株保证3～4个扦插苗成活。以M1代植株及其扩繁植株中均观察到相同的突变性状作为突变体的认定标准，从而去除环境因素对性状改变的干扰。经确认后的突变体植株种质均通过不断扦插方式保存。
中大麻资4号植株进入盛花期后，从对照小区中随机选取正常生长的15株中大麻资4号植株作为对照材料，并选取长势基本一致的突变体材料322株，取相同部位花头，参考Deng
对吉林省延边市犇福农场小区生长的每株中大麻资4号突变体植株取新鲜大麻花序0.20 g，使用TIANGEN公司植物基因组DNA提取试剂盒（DP30）提取工业大麻总DNA。根据NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）大麻参考基因组（Cs10：GCA_900626175.2）得到CsPT4、CsOAC1、CsOLS1、CBDAS和THCAS的基因组序列（包括启动子区）信息，使用Snapgene软件设计相关基因引物（表1）。使用TIANGEN公司2×Taq PCR预混试剂Ⅱ（KT211-03）进行克隆，按试剂盒说明书建议条件进行PCR反应。使用TIANGEN公司的DNA 纯化回收试剂盒（DP214） 进行PCR胶回收，方法参照说明书，回收产物使用pGEM®-T Easy试剂盒连接T载体后由北京擎科生物科技有限公司测序。
表1 本研究所用引物序列
Table 1 Primer sequences mentioned in this study
引物名称 Primers | 目的基因 Target gene | Genbank 登录号 Genbank ID | 序列（5'-3'） Sequence（5'-3'） | 片段长度（bp） Amplicon length | 用途 Purpose |
|---|---|---|---|---|---|
| CsPT4-GDNA-PART1 | CsPT4 | LOC115713185 | F： CTAACAAACCTATCTTGGGAGAATAT | 3666 |
CsPT4基因组DNA 第1部分克隆 |
| R： CAGGTCCAAGTTTGGGGTTAG | |||||
| CsPT4-GDNA-PART2 | CsPT4 | LOC115713185 | F： GATTCTGACTCTAACTTAGACATTAG | 6643 |
CsPT4基因组DNA 第2部分克隆 |
| R： AGACCCCAAGTTATATTAGCACTT | |||||
| CsPT4-GDNA-PART3 | CsPT4 | LOC115713185 | F： CACAATAGTTAAAGTGCTAATATAACTTG | 7028 |
CsPT4基因组DNA 第3部分克隆 |
| R： GGTCTTATATAAATACATATACAAAGTATTCAG | |||||
| CsOAC1-GDNA | CsOAC1 | LOC115723438 | F： AACGGAACCTTCTACCCGG | 1408 | CsOAC1基因组DNA克隆 |
| R： TAGTCTACTTTCGTGGTGTGTAG | |||||
| CsOLS1-GDNA | CsOLS1 | LOC115700696 | F： GTATTTTTACATTAAAATAATGTAT | 2620 | CsOLS1基因组DNA克隆 |
| R： ATATTTGATGGGAACACTACGC | |||||
| CsCBDAS-GDNA | CsCBDAS | LOC115697762 | F： TGGCTTGCTCTTAATTGTTTAGC | 2635 | CsCBDAS基因组DNA克隆 |
| R： TTAATGACGATGCCGTGG | |||||
| CsTHCAS-GDNA | CsTHCAS | LOC115697901 | F： GGAGAGCCAACTTTCACTATAA | 2638 | CsTHCAS基因组DNA克隆 |
| R： TTTTAAAGATAATTAATGATGATGCGGTGG | |||||
| TUB | Tubulinα-1 | JP479709 | F： CTCGGCTGAGAAAGCATACC | 102 | 持家基因 |
| R： CCATGCCTAGGGTCACACTT | |||||
| CsPT4-EXP | CsPT4 | LOC115713185 | F： CAGTGTACCAAAGTTCATAC | 153 | CsPT4表达水平 |
| R： CACAATCAAGGTCCATTAGG | |||||
| CsOAC1-EXP | CsOAC1 | LOC115723438 | F： CTGAAATCATCCCTTTTACTGCA | 110 | CsOAC1表达水平 |
| R： CAGCCATGAAAGATGTATACTG | |||||
| CsOLS1-EXP | CsOLS1 | LOC115700696 | F： GTAGTCCTGAATAGTCTCCACACTCT | 127 | CsOLS1表达水平 |
| R： GTGAACACATGACTCAACTCAAAG | |||||
| CsCBDAS-EXP | CsCBDAS | LOC115697762 | F： ATCTCGTGCTCCACCAATC | 188 | CsCBDAS表达水平 |
| R： GATCCGCTGGGCAGAACGGT | |||||
| CsTHCAS-EXP | CsTHCAS | LOC115697901 | F： CAGCAATTCCATTCCCTCAT | 63 | CsTHCAS表达水平 |
| R： TTTCAGAATCAGCAATTC |
取吉林省延边市犇福农场小区生长的每株中大麻资4号突变体植株花序0.15 g，使用TIANGEN公司植物总RNA提取试剂盒提取RNA，并用TIANGEN公司FastKingcDNA第一链合成试剂盒去除基因组DNA污染影响后，合成cDNA第一链，每个样品设置4个生物学重复。根据大麻二酚酸（CBDA，cannabidiolic acid）合成催化酶基因（CBDAS）、四氢大麻酚酸（THCA，tetrahydrocannabinolic acid）合成催化酶基因（THCAS）、香叶基焦磷酸二羟基戊基苯甲酸香叶基转移酶基因（CsPT4）、橄榄酸环化酶基因（CsOAC1）和橄榄醇合成酶基因（CsOLS1）的序列特点，使用PerlPrimer （sourceforge.net） 设计引物CsCBDAS-EXP、CsTHCA-EXP、CsPT4-EXP、CsOAC1- EXP和CsOLS1-EXP引物（表1），以大麻花序cDNA第一链为模板进行qRT-PCR分析。
使用TIANGEN公司SYBRMixture试剂盒进行qRT-PCR试验，PCR反应体系按照试剂盒说明书进行配制，扩增程序为：95℃预变性10 min；95℃变性15s，60℃退火1min，35个循环。以内参基因Tubulinα-1（表1）的Ct值作为对照，采用
在对EMS浓度梯度试验中，对不同浓度溶液处理下中大麻资4号萌发率进行统计分析，结果表明，播种后14 d，EMS明显抑制工业大麻种子萌发。EMS浓度为0时，播种后14 d中大麻资4号萌发率可达95%。当EMS浓度从0.2%提高到0.6%时，播种后14 d中大麻资4号的萌发率从87%降低至62%。当EMS浓度从0.8%提高到1.0%时，播种后14 d中大麻资4号种子的萌发率明显下降，从41%降低至25%。在1.2% EMS处理中，播种后14 d中大麻资4号种子萌发率仅为0.05%（
图1 不同浓度 EMS 处理中大麻资4号种子萌发率统计
Fig. 1 Seed germination rates of ZHONGDAMAZI 4 treated by EMS with different concentrations
经EMS诱变后，中大麻资4号M1共成苗644株，萌发率为32.2%。在不同生育阶段开展田间表型调查及统计发现多种表型发生变异（
变异类型 Variation types | 表型 Phenotype | 突变株数 Mutant plants | 突变率（%） Mutant ratio |
|---|---|---|---|
| 叶色 Leaf color | 黄化苗 | 27 | 4.19 |
| 突变为紫色 | 15 | 2.33 | |
| 花序 Inflorescence | 雌花发育退化 | 14 | 2.17 |
| 二级分枝花头生物量增加 | 10 | 1.55 | |
| 株高 Height | 植株矮化50~100 cm | 19 | 2.95 |
| 植株矮化100 cm以上 | 5 | 0.78 | |
| 总计 Total | 90 | 13.98 |
图2 中大麻资4号突变体田间表型
Fig. 2 The field phenotype of ZHONGDAMAZI 4 mutant
A、B ：叶色突变为紫色；C ：雌花发育退化（左侧为正常植株，右侧为雌花发育退化植株）；D ：矮化突变（左侧为矮化植株，右侧为正常植株）；E ：矮化突变；F ：黄化苗（左侧为黄化苗，右侧为正常植株）
A，B： Leaf color changed to purple mutant type； C： Pistillate flower degeneration type（the normal height plant showed in left， the pistillate flower degeneration plant showed in right）； D： Dwarf mutant type（the dwarf mutant showed in left， the normal height plant showed in right）； E： Dwarf mutant type； F： Etiolated seedling type（the etiolated seedling plant showed in left， the normal height plant showed in right）
中大麻资4号植株进入盛花期后，参考Deng
图3 突变体大麻素大麻二酚含量测定
Fig. 3 The detection of CDB content in mutant lines
EMS-12、EMS-79、EMS-153、EMS-58和EMS-211为不同的突变体材料
EMS-12，EMS-79，EMS-153，EMS-58 and EMS-211 are different mutation lines；CBD：Cannabinoid
大麻素合成代谢途径涉及CsOLS1、CsOAC1、CsPT4、CBDAS和THCAS 5个基因，这5个基因在催化大麻素合成过程中起关键作用。本研究对中大麻资4号大麻二酚含量突变体株系（EMS-12、EMS-79、EMS-153、EMS-58和EMS-211）和对照进行取样并通过设计特异性引物扩增以上5个基因的编码区和启动子区DNA片段并测序。DNA测序结果显示：大麻二酚含量突变体株系与对照植株相比在5个关键催化酶基因的编码区内均未发现碱基突变，其启动子区范围内DNA序列也未发生突变。因此大麻二酚含量突变体中大麻二酚含量显著变异不是由催化酶基因自身序列突变导致。
大麻二酚含量突变体株系和对照中5个催化酶的基因表达水平结果显示，与对照相比，大麻二酚含量突变体株系中不同催化酶表达水平发生明显改变，高大麻二酚含量株系EMS-12中CsPT4基因表达水平是对照的1.82倍，高大麻二酚含量株系EMS-79中CBDAS基因表达水平是对照的1.60倍，高大麻二酚含量株系EMS-153中CsOLS1基因表达水平是对照的1.51倍；低大麻二酚含量株系EMS-58的CsPT4基因表达水平相比对照下降61.76%，低大麻二酚含量株系EMS-211在CsOAC1基因表达上相比对照下降36.26%（
植株 Plants | CBDAS | THCAS | CsPT4 | CsOAC1 | CsOLS1 |
|---|---|---|---|---|---|
| 对照 CK | 7.8b | 2.5a | 3.4b | 9.1a | 6.3b |
| EMS-12 | 7.5b | 2.3a | 6.2a | 8.6a | 5.8b |
| EMS-79 | 12.5a | 2.7a | 3.1b | 8.8a | 6.7b |
| EMS-153 | 7.6b | 2.1a | 2.8b | 9.3a | 9.5a |
| EMS-58 | 7.3b | 2.5a | 1.3c | 9.0a | 6.5b |
| EMS-211 | 8.2b | 2.2a | 3.7b | 5.8c | 6.1b |
小写字母表示突变体与对照组相比在P<0.05水平差异显著
The lower-case letters indicate a significant difference between the mutant and the control group at the P<0.05 level
目前全球工业大麻种植、加工和利用的分布总体呈现了欧盟、北美、中国三大主产区的格局，以上三大产区种植面积占全球一半以上，仅2019年大麻二酚产品市场年交易额就达35亿美
本研究在工业大麻中构建了突变体群体，并对其进行表型分析。当EMS溶液浓度上升、诱变时间延长时，植物组织DNA受损程度显著加剧，导致突变体数量增多，然而，过高的损伤可能导致植物无法存活。相反，诱变剂量和诱变时间不足会降低突变发生频率并降低突变体筛选效率。不同种类作物对EMS耐受性存在较大差异，在利用EMS构建植物突变体群体时首先应摸索适合的诱变剂量和诱变时间，常采用半致死率为标准，即诱变后能够存活一半植株的EMS剂量和时间组合。诱变时间和诱变剂量对突变频率均能产生影响，本研究参考罗布麻等麻类作物的相关报
目前EMS诱变筛选突变体大多应用于一年生自交繁殖作物，此类作物大多通过自交在M2代或M3代获得纯合突变材料用于后续研究应用。在苦荞品种黑丰1号EMS突变体库创制中，研究人员采取种子混收的方式连续种植两代，到M3代进行突变体性状调
由于大麻素成分大麻二酚在抗抑郁、抗炎和缓解疼痛等方面具有重要的药用价值和临床应用前
工业大麻花叶中含有120余种大麻素，其中与大麻二酚结构相似的就有8
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