玉米黄化突变基因<bold>Zmet 9</bold>的精细定位

李永生; 王晓娟; 连晓荣; 梁根生; 何海军; 杨彦忠; 周文期; 董小云; 周玉乾; 刘忠祥; LI Yongsheng; WANG Xiaojuan; LIAN Xiaorong; LIANG Gensheng; HE Haijun; YANG Yanzhong; ZHOU Wenqi; DONG Xiaoyun; ZHOU Yuqian; LIU Zhongxiang

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玉米黄化突变基因Zmet 9的精细定位 PDF

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甘肃省农业科学院作物研究所，兰州 730070

最近更新：2025-01-23

DOI：10.19462/j.cnki.1671-895x.2023.01.025

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摘要

光合作用是植物生存的基础，叶色突变体往往伴随着叶绿体结构异常、光合色素合成受阻等表型，因此，研究叶色突变体可为光合作用和光形态建成提供实验数据和理论支撑。本研究以2.48 Gy辐照剂量的快中子辐射诱变玉米自交系PH6WC筛选得到的玉米黄化突变体et9为材料，通过表型鉴定、叶片内叶绿素含量测定、叶绿体结构显微观察、光合特性等分析，与野生型PH6WC相比突变体et9株高、穗位高极显著降低，剑叶长、剑叶宽和倒三叶宽极显著减小，抽雄、散粉、吐丝期均比野生型推迟10~12 d；叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量都显著低于野生型；叶绿体结构松散，类囊体分布混乱，垛堞基粒数量较少；净光合速率、气孔导度、蒸腾速率均极显著低于野生型，胞间二氧化碳浓度极显著高于野生型，叶绿体荧光参数除非光化学淬灭外均极显著低于野生型，遗传模式分析表明其黄化表型受一个核隐性基因所控制，命名为Zmet9。将其与玉米自交系B73杂交构建F₂分离群体，通过BSR-seq方法将突变位点初步定位在玉米第9染色体20~22 Mb区间内。进一步在初定位区间内开发4个KASP标记及2个InDel标记，利用约1100个F₂突变表型单株进行精细定位，最终将Zmet9精细定位于玉米第9染色体标记KASP19和2040之间约160 kb的区间内。该区间内含有5个候选基因，其中Zm00001d045384编码一个铁超氧化物歧化酶，与拟南芥中的同源基因FSD2、FSD3突变后出现叶色漂白的表型类似，推测Zm00001d045384可能是Zmet9的候选基因。

关键词

玉米; 黄化突变基因Zmet9; BSR-seq; 精细定位

植物突变体是挖掘控制突变性状的基因、分析基因的功能及调控网络的理想材料，叶色突变体是当前研究的热点。已在多种植物中创制并鉴定出叶色突变体，其中黄化突变最多，大多黄化突变体体内光合色素含量均明显降低，光合作用效率下降，有机物积累明显减少，从而导致植株不能正常生长，无法完成其生活史，直接导致产量降低^［

1］。据报道高等植物中发现700多个叶色突变的基因位点^{［参考文献 2

百度学术}2］。目前已报道或克隆的与玉米叶色相关基因或QTL位点有200多个^{［参考文献 3

百度学术}3］，突变位点大多定位于某条染色体或染色体的局部区域，但未进行深入的研究^{［参考文献 4

百度学术}4］。目前已知命名和精细定位的玉米叶色突变基因有23个，除4号染色体外其余染色体上均有分布^{［参考文献 5

百度学术}5］。黄绿色突变体elm2中ELM2基因为玉米HO1基因的同源基因，编码血红素加氧酶^{［参考文献 6-7}6-7］。玉米elm1突变体光敏色素积累的活性下降；淡绿色突变体elm1在长日照环境下，与野生型相比，开花时间更早，这表明光敏色素的缺失直接影响玉米开花时间。值得注意的是elm1突变体虽然光感受器受损，光敏色素积累减少，但elm1突变体在田间能够完成其生活史直至成熟^{［参考文献 8

百度学术}8］。序列对比发现，玉米elm1突变体中由于ZmHY2基因的第3个内含子的3′剪切点由G突变为A，使蛋白质翻译提前终止，从而导致突变体对光不敏感^{［参考文献 9

百度学术}9］。玉米黄绿叶突变体ygl-1由于编码cpSRP43蛋白的GRMZM2G007441基因在其编码区发生单碱基缺失，使叶绿体前体合成异常，导致叶色黄化^{［参考文献 10

百度学术}10］。玉米的vyl突变体出苗后表现出黄叶，约2周后黄叶逐渐恢复并与野生型植株相同。vyl突变体的候选基因是一种叶绿体Clp蛋白酶复合物，定位于9号染色体的VYL （Chr.9_ClpP5）基因丢失会导致玉米幼苗期叶片的褪绿表型。重复的杂合基因之间的功能冗余是VYL与其修饰子相互作用的分子机制^{［参考文献 11

百度学术}11］。近年来，生产实践中叶色突变体作为形态标记在苗期快速鉴别去除杂种^{［参考文献 12-13}12-13］、改良或育成新品种^{［参考文献 14-18}14-18］、研究功能基因组学^{［参考文献 19

百度学术}19］、园林绿化植物培育^{［参考文献 20

百度学术}20］等方面得到广泛应用。随着研究的不断深入，其作用和利用价值越来越突显。

叶色变异种类繁多，遗传规律却相差很大。从遗传因素来说，叶色突变可能受核基因控制^［

21-23］，也可能受细胞质基因控制，还可能受核质互作类型^{［参考文献 24

百度学术}24］，还存在少数由两对或以上核隐性基因控制的叶色突变体^{［参考文献 25

百度学术}25］。此外，叶色突变还受外部环境的影响。在叶绿素合成降解途径过程中，叶绿体核基因的突变通常是导致叶色突变的主要原因。大量研究结果表明，可以将叶色突变机制分为3个方面，分别为叶绿体发育，功能途径基因突变、叶绿素生物合成或降解途径的基因突变，光信号传导途径的基因突变^{［参考文献 26-28}26-28］。

本研究以快中子诱变玉米自交系PH6WC得到一个黄化突变体et9（Zea mays etiolation 9）为材料，通过对et9表型鉴定、光合色素、光合参数含量测定以及将et9与玉米自交系B73进行杂交，构建F₂群体，进行遗传效应分析和基因定位，筛选与突变基因连锁的分子标记，以期为Zmet9候选基因的鉴定及克隆奠定工作基础，进而对其进行基因功能解析以及调控网络分析，丰富叶色突变体发生的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为玉米自交系PH6WC（野生型）、B73、黄化突变体et9由甘肃省农业科学院作物研究所玉米研究室保存。突变体et9是前期工作中以2.48 Gy辐照剂量的快中子诱变玉米自交系PH6WC筛选得到，从出苗后即出现黄化表型，但并不致死，整个生育期间不返绿，开花期雄穗能正常抽雄散粉，雌穗正常吐丝，能完成授精并正常结实，全生育期长势较野生型弱。利用B73与et9杂交构建F₁群体，F₁自交获得F₂分离群体进行遗传分析和基因初定位、精细定位工作。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米黄化突变体et9的田间表型调查

将试验材料野生型PH6WC、B73、黄化突变体et9、以及B73与et9杂交的F₁、F₂群体于2022年种植在甘肃省农业科学院张掖玉米育种试验站基地，行长5 m，行距0.5 m，株距0.25 m，自交系及突变体种植2行，F₁群体种植8行，保苗150株，自交授粉，收获果穗，F₂群体种植200行，约4000株。待出苗后生长至3叶1心时，根据幼苗叶片是否黄化分别统计F₂群体中野生型和突变体植株数量，并通过卡方测验进行遗传学分析；野生型和突变体表型的判别标准：叶片黄化的为突变型表型；反之，叶片绿色的为野生型表型。成株期调查项目有：株高、穗位高、雄穗分枝数、单株叶片数、剑叶宽、剑叶长、倒三叶宽、倒三叶长、穗长、穗粗、穗行数、轴粗、出苗至抽雄天数、出苗至散粉天数、出苗至吐丝天数^［

29］。

1.2.2 野生型和突变体et9光合色素的测定

分别取野生型PH6WC和突变体et9各10株，分别在各自叶片顶端成熟区取1 cm²的叶片，避开叶脉剪成1~2 mm的长条，用镊子轻轻将叶片放进10 mL 80%丙酮溶液，在黑暗中浸提24 h至叶片呈白色，取掉叶片得到光合色素提取液；使用UV-1800分光光度计（MAPADA，China）在645 nm、663 nm和470 nm波长下分别测定叶绿素a含量（CChl.a）、叶绿素b含量（CChl.b）和类胡萝卜素含量（CCX-C），计算公式为：CChl.a=12.27×A₆₆₃-2.69×A₆₄₅；CChl.b=22.9×A₆₄₅-4.68×A₆₆₃；CCX-C=（1000×A₄₇₀-3.27×Chl.a-104×Chl.b）/229。其中，A₆₆₃、A₆₄₅、A₄₇₀分别表示测定提取液在663 nm、645 nm、470 nm处的吸光度。色素的含量（mg/cm²）=（光合色素的浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品面积^［

30］。

1.2.3 野生型和突变体et9叶绿体结构观察

在突变体et9和野生型PH6WC植株生长到3叶期时，将成熟区的叶片剪成1 mm²大小的组织浸入2.5%戊二醛戈丁溶液4℃保存备用。将组织用0.1 mol/L磷酸缓冲液（PH7.4）冲洗3~4次后，1%锇酸常温固定2 h，不同浓度梯度乙醇脱水，分别嵌入环氧树脂固定、包埋、聚合；最后用铀酰-柠檬酸铅双染色^［

30-31］。样品制备完成后用超微切片仪（Leica EM UC7， Germany）切成8~10 µm超薄切片，使用透射电子显微镜（Tecnal G2 20 TWIN，FEI， USA）在200 kV下观察并拍照。

1.2.4 野生型和突变体et9光合参数的测定

在2022年夏季玉米开花授粉期，突变体et9雌穗生长发育到吐丝时，分别选取生长发育状况相对一致的野生型PH6WC和突变体et9植株穗位叶片，于上午9：00~11：00时使用LI-6400XT光合仪（LI-COR Co. Ltd.， USA）测定光合参数，设置饱和光强为1500 μmol/ m²·s，CO₂浓度为400 μmol/mol。野生型和突变体各测10株，重复3次，t-test测验分析原始数据。叶绿素荧光参数的计算：电子传递效率（ETR，electron transport rate）和非光化学淬灭（NPQ，non-photochemical quenching）可用PAM-2500叶绿素荧光仪（WALZ， Germany）直接测得。光系统Ⅱ的效率（φPSⅡ，photosystem Ⅱ efficiency）指任一光照状态下PSⅡ实际的量子效率，即PSⅡ反应中心电荷分离的实际的量子效率。通过公式：φPSⅡ=（Fm'-Fs）/ Fm' 计算可得，其中Fm'为光下最大荧光，qP=0，qN≥0；Fs为稳态荧光产量。

1.2.5 Zmet9基因初定位与精细定位

为了定位克隆Zmet9基因，将玉米自交系B73与突变体et9杂交，构建F₂分离群体。在成株期从F₂群体中分别选择叶片黄化、叶片绿色的植株各100株，构建两个混合样品池。取样时将叶片用锡箔纸包好并立即用液氮速冻，于-80℃保存备用。总RNA提取使用天根提取试剂盒（天根生物科技，北京）提取叶片中的总RNA。RNA抽提完成后送至天津诺禾致源科技股份有限公司进行3个重复的转录组测序，所得数据参照Liu等^［

32］所述的方法进行分析。在完成初定位的基础上，开发KASP标记和InDel标记对构建的F₂群体中进行基因型检测，逐步缩小定位区间。利用天根PCR试剂盒（KT201，北京）进行扩增，PCR反应体系和测序见说明书。Zmet9基因定位所需引物见图1。

图1 野生型PH6WC（左）与玉米黄化突变体et9（右）田间表型调查

Fig. 1 Phenotype investigation of wild-type PH6WC （ left ） and maize etiolation mutant et9 （right） in the field

表1 Zmet9基因定位相关引物

Table 1 Sequence of primers used for Zmet9 mapping

引物 Primers	序列（5′-3′） Sequence（5′-3′）
KASP7-1F	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTCCTGTTTGGAAGGTAAC
KASP7-2F	GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTCCTGTTTGGAAGGTAAT
KASP7-R	CGTGCATCCACAAGGGATTC
KASP19-1F	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGACGTGAACCCAGAAAGGC
KASP19-2F	GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGACGTGAACCCAGAAAGGT
KASP19-R	CACAAGATTCTCACAGGAAG
KASP23-1F	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAACAGGCACTACGTACTCG
KASP23-2F	GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAACAGGCACTACGTACTCA
KASP23-R	ATTGGGACGTGGCAGCGATG
KASP32-1F	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGCTGCACTTCCTCTTTAGA
KASP32-2F	GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGCTGCACTTCCTCTTTAGC
KASP32-R	TGTAGTTGTTGGCTGTGGTG
2099F	TTGGATTACCTGAGGGCGTG
2099R	ACAGAGACTCAGAGGCTCAC
2037F	CGTTCTGTAGCTATCACGGT
2037R	GCACTTGAAATGCCAACCTG
2040F	GCTCACTGAAAGCTTGGCAG
2040R	CACCCCCTCGCGTAGATAAG

2 结果与分析

2.1 玉米黄化突变体et9的田间表型调查及农艺性状比较分析

田间表型调查发现，玉米黄化突变体et9从田间刚出苗就表现为黄化（图1A、B），黄化表型一直持续到整个生育期，而野生型PH6WC叶色表现正常深绿色（图1E~G）。该突变体雌雄协调，花粉量中等，花药红色，能够正常生长并结实，通过自交繁殖，黄化表型在后代中稳定遗传，说明突变位点已经纯合。突变体雄穗分枝与野生型PH6WC相同，均为独枝（图1G），生长势比野生型PH6WC明显减弱。与其他黄化致死突变体不同。

从表2可以看出，突变体et9和野生型PH6WC相比，成株期玉米黄化突变体et9的株高和穗位高极显著降低，其中株高降低约79.6 cm，穗位高降低约44 cm；雄穗分枝数均为独枝，差异不显著，单株叶片数差异不显著；剑叶长和剑叶宽差异极显著；倒三叶的叶长和叶宽较野生型PH6WC变小，倒三叶的叶宽差异极显著，叶长差异不显著，出苗至抽雄、散粉、吐丝天数均比野生型PH6WC推迟10~12 d。

表2 玉米黄化突变体et9和野生型PH6WC农艺性状考察分析

Table 2 Statistical analysis of agronomic traits in et9 and its parent PH6WC

性状Trait	PH6WC	et9	P值 P-value
株高（cm）Plant height	247.6 ± 17.3	168 ± 15.7	1.44×10^-12**
穗位高（cm）Ear height	99.3 ± 11.8	55.3 ± 10.5	8.25×10^-9**
雄穗分枝数 Number of tassel branches	0.8 ± 0.8	0.7 ± 0.7	0.138
单株叶片数 Number of leaves	13.9 ± 1.0	14.1 ± 0.6	0.173
剑叶宽（cm）Width of blade leaf	6.2 ± 0.9	5.0 ± 0.7	3.57×10^-5**
剑叶长（cm）Length of blade leaf	38.1 ± 6.6	29.8 ± 4.2	8.14×10^-5**
倒三叶宽（cm）Width of the third last leaf	9.7 ± 1.2	7.7 ± 0.9	1.15×10^-3**
倒三叶长（cm）Length of the third last leaf	60.2 ± 5.5	58 ± 5.4	0.85
穗长（cm）Ear length	14.0±0.5	11.0±0.8	9.06×10^-7**
穗粗（cm）Ear diameter	3.9±0.4	3.7±0.2	0.66
穗行数 Row number per ear	14.8±1.0	12.8±1.0	8.47×10^-3*
轴粗（cm）Axis diameter	2.5±0.3	2.4±0.2	0.045 *
出苗至抽雄天数（d）Days from emergence to tasseling	75.5±1.6	86.4±1.2	1.96×10^-9**
出苗至散粉天数（d）Days from emergence to pollen shedding	77.1±1.4	89.4±0.8	1.97×10^-9**
出苗至吐丝天数（d）Days from emergence to silking	78.0±1.4	90.5±0.8	2.6×10^-9**

表中PH6WC和et9的数据为平均值±标准差； *和**：分别在P<0.05和P<0.01水平差异显著；下同

The data of PH6WC and et9 in the table were mean ± standard deviation； * and ** mean significant difference at P<0.05 and P<0.01，respectively； The same as below

2.2 突变体et9的光合色素含量测定

由于光合色素的含量能显著影响叶色以及植物的光合作用，光合色素含量减少造成植物光合作用效率降低，最终导致植物提早死亡或产量降低。本试验中利用分光光度计测定野生型PH6WC和突变体et9的光合色素含量，结果表明与野生型相比，突变体et9的叶绿素a含量、叶绿素b含量及类胡萝卜素的含量均显著降低，et9为总叶绿素缺乏突变体（图2）。光能的吸收、传递、转化都需要光合色素发挥作用，突变体的光合色素含量降低可能显著限制了光合作用的进行，导致了黄化表型的产生。

图2 野生型 PH6WC与突变体et9色素含量

Fig. 2 Pigment content of wild-type PH6WC and mutant et9

***：P<0.001水平差异显著；下同

Chl.a：Chlorophyll a； Chl.b：Chlorophyll b； CX-C：Carotenoids； *** mean significant difference at P<0.001； The same as below

2.3 突变体et9的叶绿体结构分析

对野生型PH6WC和突变体et9的叶绿体结构通过透射电子显微镜进行观察，发现在野生型材料中，叶绿体呈纺锤型，内部的类囊体垛堞紧密，基粒结构清晰；而在et9中，叶绿体结构松散，类囊体分布混乱，没有垛堞成基粒或者垛堞基粒数量非常少（图3）。电子传递链和光合色素分布在类囊体上，承担着光反应的进行，突变体中基粒类囊体减少会使得光能向活跃的化学能转化不足，影响后续的暗反应等。由此可见叶色突变体常常伴随着叶绿体结构异常，从而导致光合色素的产生和行使功能异常、植物光合能力降低等一系列变化。

图3 透射电镜下的野生型PH6WC和突变体et9叶绿体结构

Fig. 3 Chloroplasts structure of wild-type PH6WC and mutant et9 under transmission electron microscope

ST：基质类囊体；GT：基粒类囊体

ST： Stromal thylakoid； GT： Grana thylakoid

2.4 突变体et9的光合特性分析

为探究叶绿素含量及叶绿体结构变化对et9光合特性的影响，对et9和野生型PH6WC进行了光合参数和叶绿体荧光参数的测定。光合参数测定表明et9的净光合速率、蒸腾速率和气孔导度均极显著低于野生型PH6WC（图4A~C）；但由于光合速率降低，突变体对二氧化碳的利用能力降低，导致et9的胞间二氧化碳浓度极显著高于野生型PH6WC（图4D）。

图4 野生型PH6WC和突变体et9植株的光合参数

Fig. 4 Photosynthetic parameters of wild-type PH6WC and mutant et9 plants

光合作用的大多数过程都可以通过叶绿素荧光反应出来，如非光化学淬灭、光系统Ⅱ的效率、电子传递效率等。经t-test，et9的非光化学淬灭显著高于野生型PH6WC（图4F），光系统Ⅱ的效率和电子传递效率显著低于野生型PH6WC（图4E、G）。非光化学淬灭能表示植物的光保护能力，而光系统Ⅱ的效率能表示光抑制程度，突变体中两者数值变化表明突变体耗散过剩光能的能力较差，发生了光抑制。

2.5 突变性状的遗传学分析

将B73与et9杂交进行遗传学分析，结果表明无论正反交F₁所有植株为正常叶色，而F₂中野生型和突变体的分离比符合3：1（χ²=0.065<χ²_0.05=3.84），与孟德尔遗传定律相符，因此得出黄化性状是由一个核隐性基因所控制的（表3），并将该基因命名为Zmet9（Zea mays etiolation 9）。

表3 F₂分离群体的卡方测验表

Table 3 Chi-square test table for F₂ isolated population

群体Population

观察值

Observations

期望值

Expectations

卡方检验

Chi-square

B73

et9

B73

et9

F₂

532

165

522.75

174.25

0.065

2.6 Zmet 9初定位与精细定位

为克隆候选基因，从F₂群体中分别选取100株野生型表型和100株突变体表型植株的叶片，分别等量混合构建野生型表型和突变体表型两个混池并抽提RNA，进行转录组测序；测序数据通过贝叶斯统计分析的方法，将目的基因初定位于玉米第9染色体20~22 Mb区间约2 Mb的区间内（图5）。

图5 BSR-seq分析揭示黄花突变基因 Zmet9的遗传定位

Fig. 5 The genetic allocation of the etiolation mutant gene Zmet9 revealed by BSR-seq

为了验证初定位区间的正确性，在初定位的基础上通过一个含有150个单株的F₂群体对BSR-Seq的结果进行验证。选取BSR-seq数据中突变体和野生型间测序深度大于30×的SNP位点开发标记，共开发33对标记，其中有22个标记在两亲本间具有多态性，经过筛选后选取其中效果较好、位于区间两端的4个标记KASP7、KASP19、KASP23和KASP32，对150个突变体单株进行基因型检测，在KASP19和KASP23之间共筛选得到47个交换单株，将目的基因定位在第9染色体20245043~21984785 bp之间约2 Mb的区间内，证实了初定位区间的准确性。由于KASP19和KASP23之间仍有交换，在该区间内开发了一个InDel标记2099，并进一步缩小区间，将目的基因定位在约750 kb的区间内。为进一步缩小目的基因Zmet9的定位区间，利用KASP19、2099和新开发的两个InDel标记2040、2037，对来自F₂群体的1100个突变体单株进行基因型鉴定，共筛选到51个交换单株，通过对交换单株基因型分析，将目的基因定位在KASP19和2040之间约160 kb的区间内（Chr9：20245023~20402375 bp），该区间内含有5个候选基因（表4、图6）。

表4 精细定位区间内的5个基因

Table 4 Genes within the fine-mapping interval

基因 ID Gene ID	功能描述 Gene description	基因类型 Gene type
Zm00001d045384	超氧化物歧化酶	蛋白质编码基因
Zm00001d045385	-	蛋白质编码基因
Zm00001d045386	ERF转录因子	蛋白质编码基因
Zm00001d045387	脂酰基-ACP硫酯酶	蛋白质编码基因
Zm00001d045388	假定的D -甘露糖结合凝集素受体样蛋白激酶	蛋白质编码基因

-：功能未知

-： Function unknown

图6 Zmet9的精细定位

Fig. 6 Fine mapping of Zmet9

Marker：标记名称；N：群体大小；Recombinant：重组单株数；红色图注表示定位区间

Marker： Marker names； N： Size of F₂ population used in mapping； Recombinant： The number of recombinants； The red captions indicate the mapped region

从表4可知，精细定位区间的5个基因中，Zm00001d045384编码一个超氧化物歧化酶，与拟南芥中的同源基因FSD2、FSD3（AT5G23310）突变后出现叶色漂白的表型类似。通过氨基酸序列比对发现Zm00001d045384基因编码蛋白与拟南芥FSD3基因编码蛋白同源（图7）。

图7 候选基因Zm00001d045384与FSD3编码蛋白的氨基酸序列比对

Fig. 7 Sequence alignment of animo acid sequence of Zm00001d045384 with FSD3

其余4个基因中Zm00001d045385编码一个功能未知的蛋白，在拟南芥中无同源基因，在水稻中的同源基因功能未知。Zm00001d045386注释为一个ERF转录因子，但经预测其只有一个PBD结构域，而不存在典型的AP2/ERF结构域，功能有待进一步确认。Zm00001d045387编码一个脂酰基-ACP硫酯酶，是脂肪酸合成过程中最后一步脂酰基与ACP解离所需要的酶；其在拟南芥中的同源基因FTAB突变会导致种子含油量变化。Zm00001d045388编码一个假定的D-甘露糖结合凝集素受体样蛋白激酶，同源基因未见报道（表4）。根据基因功能注释，推测Zm00001d045384可能是Zmet9的候选基因。

3 讨论

3.1 et9是一个新的特异性黄化突变体

叶色突变体的产生受到叶绿体结构和叶绿素含量的影响。黄化突变体是叶色突变体中比较丰富的一类，一般由于缺少叶绿素，叶绿体发育不良致使突变体捕获、传递、转化光能的能力弱、光合作用效率低。目前发现的黄化突变体多在某个生长阶段死亡（如苗期或生长后期）。多数黄化突变体难以完成正常生命周期开花结实。如玉米黄化突变体crs4由于对应的等位基因丢失导致光合酶复合物合成与降解失衡，叶片呈浅黄绿色、光合作用异常，幼苗期即致死；crs1缺失叶绿体ATP合成酶导致叶片淡绿致死；crp1无法正常合成细胞色素和光系统I的效率，幼苗淡绿色致死；why1苗期出现白化病，成熟期胚形成受阻，胚乳发育正常^［

33］。nec-t苗期叶片表现出黄绿色，随后叶片上出现坏死斑，短时间内植株萎蔫死亡^{［参考文献 34

百度学术}34］。另据报道FSD2、FSD3基因的T-DNA插入的突变体都表现出黄化或白化的表型^{［参考文献 35

百度学术}35］。拟南芥中的同源基因FSD2、FSD3有报道其突变后出现叶色漂白的表型，不同的是fsd3突变体不能存活至苗期以上，但其同家族基因FSD2的突变体fsd2则可以存活至苗期^{［参考文献 36

百度学术}36］；FSD2和FSD3在早期叶绿体发育中起着重要作用，fsd2-1fsd3-1双突变体在琼脂平板上具有严重的白化表型，而fsd2和fsd3单敲除突变体具有浅绿色表型^{［参考文献 37

百度学术}37］；本研究的黄化突变体et9，种子播种一出苗就出现黄化表型，整个生育期均不返绿、不致死。与野生型相比，生长缓慢，雄穗能正常抽雄散粉，抽雄、散粉、吐丝期均比野生型推迟10~12 d，能完成授精最后正常结实，黄化性状能够稳定遗传。故此推断et9是一个区别于已报道黄化突变体的特异性黄化突变体。

3.2 Zmet9可能为一个新的黄化突变基因

目前已经精细定位并克隆的玉米黄化突变基因有23个，分布在玉米除第9染色体以外的9条染色体上。elm1基因定位于第8染色体163614240~163618286 bp的区间内，其编码一个叶绿素铁氧还蛋白氧化还原酶^［

38］；ygl1基因定位于第1染色体7311454~7312602 bp的区间内，YGL1是编码叶绿素合成酶的基因，该基因突变后导致叶绿素合成酶的合成与积累减少^{［参考文献 39

百度学术}39］；why1基因定位于第6染色体74547569~74550576 bp的区间内，该基因编码叶绿体单链核酸结合蛋白，突变后导致atpF无法正常剪接及23S rRNA无法成熟，突变体缺少质体核糖体，在苗期淡绿色致死^{［参考文献 40

百度学术}40］。eti1突变体目标基因定位在3号染色体SSR标记146-M194和147-M92之间约815 kb区间^{［参考文献 41

百度学术}41］；xy122从萌发出芽就为黄色，从六叶期开始叶色逐渐由黄转绿直至生育期结束。xy122突变基因精细定位于第3染色体C50和G20标记之间约32.59 Mb的区间，该区间通过全基因组重测序共检测到92521个SNP和20个InDels^{［参考文献 42

百度学术}42］；黄化突变体74101自萌发期直至整个生育期结束均为黄化表型，不影响正常授粉结实。该基因初定位于第5染色体K-138和K-27标记之间约76.05 kb的物理距离。基因序列扩增比对分析发现，该基因存在点突变使翻译提前终止。在提前终止的EMS株系及敲除株系均在三叶期观察到与74101相同表型的黄化叶片^{［参考文献 43

百度学术}43］；yglm1从幼苗生长到结实成熟的整个生育过程中，叶片细长，茎杆纤细，整个生育期叶色为黄化表型，但能正常结实。基因精细定位与克隆未见报道^{［参考文献 44

百度学术}44］；拟南芥EMS诱变Col-0筛选的突变体27-24具有叶片呈黄色、植株矮小等表型，研究发现该突变体的表型与超氧化物歧化酶突变的表型一致，该突变体是由AtFSD3（At5g23310）发生点突变所致。该突变基因定位在第5染色体的6.61~8.60 Mb之间，该基因cDNA序列中的第748位碱基由G变为A，导致FSD3蛋白中Glu 250转变为Lys 250^{［参考文献 35

百度学术}35］。粳稻后期黄化突变体lle基因定位于第8号染色体上，根据ANNOVAR的注释分析推测第8号染色体上参与编码PPR重复结构域蛋白的基因LOC_Os08g17080为候选基因^{［参考文献 45

百度学术}45］。番茄黄化突变体ym基因定位于第2染色体上4.4 Mb（50800001~55200000 bp）区间内，该区间筛选到两个在转录组中呈现下调表达的候选基因Solyc02g093180、Solyc02g092460^{［参考文献 46

百度学术}46］。本研究的黄化突变体et9与yglm1、74101、27-24类似，从种子萌发出苗就出现黄化表型，整个生育期均不返绿、不致死，黄化性状能够稳定遗传，均由一对隐性核基因控制。与野生型相比，生长缓慢，雄穗能正常抽雄散粉，雌穗正常吐丝，抽雄、开花散粉、吐丝时间较野生型晚10~12 d左右，能完成授精最后正常结实。区别在于基因精细定位在不同的染色体和基因结构的差异。et9基因精细定位于第9染色体（Chr9：20245023~20402375 bp）标记KASP19和2040之间约160 kb的区间内，该区间内含有5个候选基因，其中Zm00001d045384编码一个铁超氧化物歧化酶，与拟南芥中的同源基因FSD2、FSD3突变后出现叶色漂白的表型类似。通过对Zm00001d045384基因进行生物信息学分析和预测，结合玉米数据库中玉米10条染色体上已经精细定位的叶色黄化突变体，比较Zmet9与这些突变基因定位的具体位置、突变植株的表型等，推测Zm00001d045384可能是Zmet9的候选基因，Zmet9可能是一个未曾报道的新的黄化突变位点。

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