玉米籽粒高蛋氨酸突变体<bold>Zmts1</bold>的鉴定与转录组分析

洪泽渊; 鲁鑫; 汤泽洋; 周志强; 郭长虹; 李新海; HONG Zeyuan; LU Xin; TANG Zeyang; ZHOU Zhiqiang; GUO Changhong; LI Xinhai

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玉米籽粒高蛋氨酸突变体Zmts1的鉴定与转录组分析 PDF

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1. 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，哈尔滨 150025； 2. 中国农业科学院作物科学研究所/作物基因资源与育种全国重点实验室，北京100081

最近更新：2025-01-23

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240515002

摘要

蛋氨酸是畜禽类玉米-豆粕型日粮的第一限制性氨基酸，氨基酸不平衡会导致机体蛋白质合成受到抑制从而影响肉和奶的品质。为解析玉米籽粒蛋氨酸积累的调控机制，本研究利用同源克隆方法获得了影响蛋氨酸含量的候选基因ZmTS1（Threonine synthase1），通过玉米突变体材料验证ZmTS1基因功能，发现与野生型相比，Zmts1突变体籽粒中蛋氨酸含量提高了60%，SDS-PAGE凝胶电泳结果表明Zmts1突变体成熟籽粒中富含蛋氨酸残基的10 kDa δ醇溶蛋白较野生型有了显著提高，验证了该基因可显著提高玉米籽粒中蛋氨酸含量。生物学信息分析结果表明，该蛋白含有一个苏氨酸合酶结构域，属于亲水性蛋白。通过转录组分析挖掘与蛋氨酸代谢相关的差异表达基因，共筛选到1144个差异表达基因，其中571个基因表达上调， 573个基因表达下调。GO和KEGG富集通路分析表明，差异表达基因主要参与氨基酸的生物合成和代谢途径。利用qRT-PCR进一步验证了7个可能参与蛋氨酸代谢途径的关键候选基因，RNA-Seq与qRT-PCR的表达模式一致，表明7个基因能间接调控蛋氨酸代谢途径。本研究为高蛋氨酸玉米育种提供了新的种质资源，也为玉米蛋氨酸调控机制提供一定的理论依据。

关键词

玉米; 蛋氨酸; Zmts1突变体; 转录组分析

玉米（Zea mays L.）是我国第一大粮食作物，其中60％以上的玉米被用作饲料。富硫氨基酸（蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸）特别是蛋氨酸是畜禽类玉米-豆粕型日粮的第一限制性氨基酸，对动物的生长发育起着至关重要的调控作用。蛋氨酸作为蛋白质合成的底物，直接参与动物机体蛋白质的从头合成^［

1-2］；蛋氨酸在蛋氨酸腺苷转移酶的作用下生成S-腺苷蛋氨酸（SAM，S-adenosylmethionine），SAM是动物重要的甲基供体，可供甲基参与蛋白质、DNA和RNA的甲基化^{［参考文献 3

百度学术}3］；蛋氨酸还能提供活性羟基基团，补充胆碱或维生素B₁₂的部分作用；在体内代谢生成聚胺，对动物生长具有非常重要的促进作用；同时它可由代谢中间产物同型半胱氨酸（Hcy， homocysteine）通过转硫化途径生成半胱氨酸，代谢生成抗氧化产物，提高机体抗氧化能力^{［参考文献 4

百度学术}4］。因此，提高玉米籽粒蛋基酸含量对畜禽产业发展具有重要意义。

高等植物中的蛋氨酸合成为3个连续的酶促反应，主要发生在叶绿体中。首先半胱氨酸和O-乙酰高丝氨酸（OPH， O-phosphohomoserine）作为共同底物，在胱硫醚-γ-合成酶（CGS， cystathionine-γ- synthase）的催化作用下，生成胱硫醚（Cystathionine）。然后以胱硫醚作为底物，在胱硫醚β裂解酶（CBL， cystathionine β-lyase）的催化作用下，生成高半胱氨酸。最后以高半胱氨酸作为底物，经蛋氨酸合成酶（MS， methionine synthase）催化作用将其转化生成蛋氨酸^［

5］。

在模式生物拟南芥中，苏氨酸合成酶（TS， threonine synthetase ）位于苏氨酸（Thr， threonine）和蛋氨酸生物合成的分支点，与CGS竞争共同底物 O-磷酸高丝氨酸^［

6］，对OPH的利用效率仅取决于二者的含量^{［参考文献 7

百度学术}7］。研究发现，蛋氨酸的直接代谢产物SAM对TS有正向调节作用，蛋氨酸反馈抑制CGS^{［参考文献 8

百度学术}8］。可以通过改造CGS，减弱蛋氨酸的反馈抑制作用，或减少TS来合成更多的蛋氨酸。通过将AtCGS 基因在拟南芥、烟草、马铃薯、苜蓿中过表达，植株中蛋氨酸含量能够显著增加，说明该基因对蛋氨酸合成起到正调控作用^{［参考文献 9-11}9-11］。在拟南芥ts突变体 mto2-1（Leu-204 to Arg）中，蛋氨酸含量较野生型提高了近100倍，这为通过抑制TS基因表达来提高蛋氨酸含量提供了可能^{［参考文献 12

百度学术}12］。但目前除拟南芥外，在其他植物中通过抑制TS合成来提高蛋氨酸含量的研究还未见报道。

本研究以编码玉米苏氨酸合酶的基因ZmTS1为研究对象，利用生物信息学分析玉米ZmTS1蛋白特征，以及实时荧光定量分析玉米ZmTS1基因在授粉后不同时期各组织中的表达水平。分析玉米Zmts1突变体及野生型B73的籽粒氨基酸含量变化，并通过转录组测序分析Zmts1突变体和B73的差异表达基因，进而对ZmTS1基因功能进行初步验证，为优质蛋白玉米分子遗传改良提供基因资源和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米自交系B73和Zmts1突变体于2021年5月种植于北京昌平中国农业科学院试验基地，行长3 m，株距25 cm，每行均匀点播13粒，常规田间管理。玉米自交系B73由中国农业科学院作物科学研究所玉米优质抗逆育种课题组提供。Zmts1突变体购买于MEMD（www.elabcaas.cn/memd/），与野生型亲本B73回交两代后再自交构建BC₂F₂群体，得到Zmts1纯合突变体。

1.2 试验方法

1.2.1 ZmTS1基因的同源克隆

通过Gramene 网站（https：//www.gramene.org/）获得玉米自交系B73中ZmTS1基因的CDS序列。根据ZmTS1基因的CDS序列设计引物（表1），取3株玉米B73灌浆期的叶片，使用总RNA提取试剂盒RNA-easy Isolation Reagent（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）提取RNA，cDNA逆转录试剂盒FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（北京天根生化科技有限公司）将RNA反转录成cDNA，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司2×Phanta Flash Master Mix（Dye Plus），以玉米B73叶片cDNA为模板，克隆ZmTS1基因编码区序列，ZmTS1扩增片段经胶回收后连接B-Zero载体pEASY®-T&B Zero Cloning Kit（北京全式金生物技术股份有限公司）。利用载体通用引物M13F和M13R测序，引物合成和测序工作在北京华大基因公司完成。

表1 本研究引物信息

Table 1 Information of the primers in this study

引物名称 Primer name	正向引物（5'-3'） Forward primer （5'-3'）	反向引物（5'-3'） Reverse primer （5'-3'）	功能 Function
CDS-ZmTS1	CTGCCCTCCCTAAACGAAA	GGAAAGGCTAGAGCAAACAAC	同源克隆
EMS-Zmts1	AGGGTTTCTCTGCGTGGTACG	TGCATAGATATTCCCAAGATTGC	突变体鉴定
ZmUbi	TAAGCTGCCGATGTGCCTGCGTCG	CTGAAAGACAGAACATAATGAGCACAG	qRT-PCR引物
RT-ZmTS1	CGCCATCGTGTTCCTGC	GCTGTCTTCTGCCCCTCAA
Zm00001d008883	AACCTCGAAGCCTTCTTCTCTG	TGCTCTCCACTTAAACCACTACTGA
Zm00001d018386	GTAGTCAAGAAGGCTGAAAATC	ATCCAGTGCCCGAGAGA
Zm00001d034460	GAGAGGATAGGAATAAGAGAGG	TCCAGAACCAGAAGAGAGC
Zm00001d049823	GCCAAAGGAGCAAGCA	GGGGACACATATCCAGAGA
Zm00001d050495	TTCTGCTGTCCACGGCT	TGGTTGCACAAAGTTTCCT
Zm00001d048060	GCCTAAACCATCTCATTCTCA	TCCTCCAACACCCCCAT
Zm00001d050133	CGCCTGTCTTCCTACCT	TCCAATACGACCTTCTAACT

1.2.2 突变体株系基因型鉴定

取田间种植的BC₂F₂植株散粉期新鲜叶片20株，CTAB法提取DNA，在MEMD突变体库中查询Zmts1提前终止突变体的突变位点，在突变位点前后500 bp设计测序引物EMS-Zmts1（表1），以BC₂F₂植株DNA为模板进行PCR扩增，PCR体系包括1 μg/μL 模板DNA 0.8 μL ，引物各0.8 μL（正向和反向），8 μL Mix（2×Phanta Flash Master Mix（Dye Plus），诺唯赞生物科技股份有限公司），用水补足到20 μL。PCR反应程序为98℃预变性30 s；98℃变性10 s，60℃复性5 s，72℃延伸3 s，30个循环；最终72℃ 1 min。扩增PCR产物送至北京华大基因公司测序。

1.2.3 突变体株系氨基酸含量测定

以野生型B73序列为参考比对测序结果，选取纯合突变株系分析籽粒蛋氨酸表型。参照国标NY/T 56-1987《谷物籽粒氨基酸测定的前处理方法》的酸水解法进行^［

13］前处理，用自动氨基酸分析仪（日立L-8900，日本）测定富硫氨基酸（蛋氨酸）含量。选取3行、每行中间3株突变体和野生型自交果穗、同株的叶和茎收获后晾干，从每一果穗的中间部位选生长正常、一致和饱满的种子混合，继续用烘箱60℃烘48 h，随后用磨样机将其磨碎成粉，用于氨基酸的测定。氨基酸测定具体方法如下：称取50~70 mg 磨碎的玉米粉末放入标有10 mL刻度的试管中，并加入10 mL 6 mol/L的HCl在110℃烘箱中烘22~24 h，使样品充分水解。取出后冷却至室温，过滤溶解好的溶液至50 mL容量瓶中，用双蒸水定容至50 mL，充分混匀，取750 µL利用旋转蒸发仪加热至45~60℃旋转蒸干，再用750 µL 0.02 mol/L HCl溶解干燥的样品，充分混匀，然后取20 µL重悬液进行测定，每个样品测定2个技术重复^{［参考文献 14

百度学术}14］。本试验所有样品处理及检测均由河南农业科学院质量标准研究所完成。

1.2.4 籽粒醇溶蛋白提取

取授粉后成熟籽粒磨碎，称取0.1 g籽粒粉末加1 mL提取液（70% 无水乙醇、2%β-巯基乙醇），37℃摇床充分震荡2 h，然后12000 rpm/min 离心10 min，上清为醇溶蛋白。取100 μL上清液加10 μL 10%的SDS，烘干后加水溶解蛋白，溶解后的蛋白加入5×Loading Buffer 95℃煮沸5 min，使蛋白质完全变性，最后吸取3~6 μL的上样液用12.5%的SDS-PAGE进行电泳分析，SDS-PAGE凝胶制备电泳试剂盒购自北京博泰斯生物技术有限公司。

1.2.5 ZmTS1基因的生物信息学分析

依据ZmTS1基因编码的氨基酸序列，利用在线软件ExPASY对ZmTS1蛋白亲疏水性分析^［

15］；在线软件TMHMM^{［参考文献 16

百度学术}16］对ZmTS1蛋白跨膜结构分析；在线软件Net Phos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Net Phos/）对ZmTS1蛋白磷酸化位点进行分析；在线软件SOPMA^{［参考文献 17

百度学术}17］对ZmTS1蛋白二级结构等进行预测分析。采用在线工具Ortho DB（https：//www.orthodb.org/）对ZmTS1蛋白进行同源性分析，找出与其亲缘关系近的物种基因号，利用DNAMAN 9软件和MEGA 7软件^{［参考文献 18

百度学术}18］将序列导出和绘制进化树。

1.2.6 ZmTS1基因的表达模式分析

在相同田间管理条件下，以玉米自交系B73和Zmts1突变体为实时荧光定量实验材料，取授粉后10 d、15 d、20 d、25 d、30 d的玉米籽粒和授粉后20 d的根、茎、叶、花丝等组织，用液氮冻存后放入-80℃冰箱保存，每个处理均有3次生物学重复。使用RNA-easy Isolation Reagent试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）提取RNA并进行RNA完整性和浓度检测，使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix试剂盒（北京天根生化科技有限公司）合成cDNA，以野生型B73和Zmts1突变体玉米的cDNA为模板，以ZmTS1基因为目标基因，ZmUbi为内参基因引物，RT-ZmTS1为基因引物（表3），使用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（北京天根生化科技有限公司）荧光定量试剂盒检测野生型玉米B73和Zmts1突变体玉米中ZmTS1基因的表达水平。

1.2.7 转录组测序

以玉米B73和Zmts1突变体授粉后20 d的籽粒胚乳为材料，设置3个生物学重复^［

19-20］。转录组测序包括样品RNA提取、样品纯度和RNA长度检测、文库构建、文库质量检验、上机测序等环节，由北京奥维森基因科技有限公司完成。对测序原始数据进行过滤获得高质量的Clean reads，以玉米B73基因组为参考基因组，用STAR软件将Clean reads比对到参考基因组上，比对完成后将比对上的Reads进行组装和定量分析。

1.2.8 差异表达基因分析

利用HTSeq软件分析基因的表达水平，采用FPKM（Fragments per kilobase of exon model per million mapped reads）值为1作为判断基因是否表达的评价指标。绘制火山图分析差异基因的分布情况。将差异基因筛选的标准定义为： |log₂FC|≥1且P-value<0.05，确保试验误差在控制范围内。

1.2.9 qRT-PCR验证

选取7个蛋氨酸通路的差异表达基因，使用Primer 5软件设计定量引物（表1），引物序列由华大基因合成，以玉米中ZmUbi为内参基因，以野生型和BC₂F₂突变体株系授粉后20 d籽粒cDNA为模板进行qRT-PCR验证。qRT-PCR扩增体系为1 μg/mL模板cDNA 0.8 μL，1 mol/L正向和反向引物各0.8 μL，8 μL Mix酶，无菌水将体系补足至20 μL。PCR反应过程为98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，60 ℃复性5 s，72 ℃延伸2 s，30个循环；72 ℃ 1min。每个样品设置3个生物学重复和3次技术重复，重复之间的Ct值控制在±0.5，利用公式2^-△△Ct计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 ZmTS1基因的同源克隆

在线工具Ortho DB分析显示，ZmTS1与高粱（SORBI3003G265400）、谷子（SETIT000999m.g）、水稻（Os01g0693800）、短柄草（BRADI2G47240）和拟南芥（AT1G72810）存在同源关系。使用MEGA7.0软件分析玉米ZmTS1蛋白和多种植物的同源蛋白，进行多重序列比对并进行系统进化树的构建，结果表明玉米ZmTS1与高粱（SORBI3003G265400）蛋白亲缘关系最近。拟南芥AT1G72810参与苏氨酸和蛋氨酸代谢^［

6］，因此推测ZmTS1基因具有相似的调控苏氨酸和蛋氨酸代谢功能（图1A）。对从玉米B73 cDNA中克隆获得的ZmTS1的基因编码区（CDS）片段进行凝胶电泳检测（图1B）并测序，结果证实其CDS片段长1584 bp，编码527个氨基酸。

图1 ZmTS1 进化树分析与ZmTS1基因同源克隆

Fig. 1 Evolutionary tree analysis of ZmTS1 and homologous cloning of ZmTS1 gene

A：ZmTS1 进化树分析；B：ZmTS1基因克隆

A：Phylogenetic tree analysis of ZmTS1； B： ZmTS1 gene cloning；M：DL 5000 Marker

2.2 ZmTS1基因的功能验证

以突变体Zmts1和野生型B73为材料，对ZmTS1基因进行基因型鉴定。结果表明，该突变体外显子上TGG/TAG碱基变异，导致该基因提前终止转录（图2）。为了验证ZmTS1基因突变后对玉米不同组织中氨基酸含量是否产生影响，对突变体Zmts1和野生型B73的籽粒、叶以及茎进行氨基酸含量测定。与野生型B73相比，除茎组织外，总氨基酸含量在突变体Zmts1和野生型B73的籽粒与叶片间无显著性差异，而Zmts1突变体籽粒、叶、茎的蛋氨酸含量均极显著高于野生型（图3A、B）。

图2 Zmts1基因型检测及果穗表型

Fig. 2 The genotype and ears phenotype of Zmts1

A：突变体Zmts1和野生型B73基因结构；B：Zmts1基因型检测，表示变异位点；C：突变体Zmts1和野生型B73的果穗表型

A： Wild-type B73 and ZmTS1 gene structure； B： Zmts1 genotype testing， indicates a variant site；C： Ears phenotype of Wild-type B73 and Zmts1

图3 B73和Zmts1突变体的蛋氨基酸含量测定及SDS-PAGE分析

Fig. 3 Determination of methionine content and SDS-PAGE analysis of B73 and Zmts1 mutants

M：Marker；**表示达到极显著水平（P＜0.01）；*表示达到显著水平（P＜0.05）；ns表示无显著性差异；下同

**denotes highly significant level （P＜0.01）； * denotes significant level （P＜0.05）；ns denotes no significant difference； The same as below

为了观察突变体Zmts1和野生型B73籽粒中与含硫氨基酸相关的醇溶蛋白亚基丰度，分别提取野生型与Zmts1授粉后成熟籽粒的胚乳醇溶蛋白（Zein），利用SDS-PAGE凝胶电泳分析不同醇溶蛋白亚基表达情况。结果表明，在授粉后成熟籽粒的胚乳中，醇溶蛋白各亚基在野生型与突变体中均无明显差异；在全籽粒中，突变体富含蛋氨酸残基的10 kDa δ-醇溶蛋白蛋白有了明显提高，富含半胱氨酸残基的27 kDa γ-醇溶蛋白和16 kDa γ-醇溶蛋白含量也相对提高，而富含蛋氨酸和半胱氨酸残基很低的醇溶蛋白亚基如19 kDa α-醇溶蛋白和22 kDa α-醇溶蛋白的含量在二者间无明显变化（图3C）。

2.3 ZmTS1基因的表达模式分析

对突变体Zmts1和野生型B73进行同步取样，分析ZmTS1基因的时空表达模式。分析发现，Zmts1突变体中ZmTS1基因的相对表达量较野生型极显著降低，在授粉后10~30 d的胚乳及20 d的叶、茎、籽粒、花丝和根中，差异均达到极显著水平（图4A）。在各个组织和不同时期胚乳中，B73中ZmTS1在叶片的相对表达量最高，其次是授粉后10 d的胚乳（图4B），说明ZmTS1基因可能主要在叶片和籽粒胚乳中受到调控表达。

图4 B73和Zmts1突变体不同组织ZmTS1基因的时空表达模式

Fig. 4 Spatio temporal expression patterns of the ZmTS1 gene in different tissues of B73 and Zmts1 mutant

A：B73和Zmts1中ZmTS1基因的时空表达模式； B：B73中ZmTS1基因的时空表达模式； d：代表授粉后天数

A：Spatiotemporal expression patterns of the ZmTS1 gene in B73 and Zmts1；B：Spatiotemporal expression pattern of the ZmTS1 gene in B73； d represents the number of days after pollination

2.4 ZmTS1基因的生物信息学分析

Prot Param在线分析ZmTS1基因编码527个氨基酸，相对分子量57.6 kDa，等电点为6.44，消光系数72350，不稳定系数 34.91（<40），是一种稳定蛋白。亲水性为-0.178（>-0.5），属于亲水性蛋白（图5A）。通过TMHMM预测蛋白序列跨膜结构，ZmTS1属于非跨膜蛋白（图5B）。Net Phos3.1分析显示，ZmTS1蛋白含有26个丝氨酸磷酸化位点、12个苏氨酸磷酸化位点以及4个酪氨酸磷酸化位点（图5C）。InterPro分析结果表明，ZmTS1含有1个苏氨酸合酶结构域（图5D）。SOPMA在线分析表明，ZmTS1的二级结构中含有202个α 螺旋（38.33%），39个β 转角（7.40%），209个延伸链（39.66%），77个无规则卷曲（14.61 %）（图5E）。

图5 ZmTS1蛋白的生物信息学预测分析

Fig. 5 Bioinformatics predication analysis of ZmTS1 protein

A：亲疏水性预测；B：跨膜结构预测；C：磷酸化结构预测；D：ZmTS1结构域分析；E：ZmTS1二级结构分析；α 螺旋用蓝色表示；β 转角用绿色表示；延伸链用红色表示；无规则卷曲用紫色表示；横坐标处为氨基酸序列的序号

A： Hydrophilicity prediction； B：Prediction of transmembrane structure；C： Prediction of phosphorylation structure； D： ZmTS1 structural domain analysis；E： Secondary structure analysis of ZmTS1； Alpha helixes are shown in blue； Beta turns are shown in green； Extended strands are shown in red； Random coils are shown in purple；The horizontal coordinate indicates the position of the protein sequence

2.5 Zmts1突变体的转录组分析

利用转录组测序技术分析突变体中ZmTS1基因突变是否影响其他基因的表达。对B73和Zmts1突变体授粉后20 d的籽粒胚乳提取RNA进行转录组测序。通过对6个样品的转录组分析获得43.74 Gb的测序数据。6个测序样品的Q20值均在97.66%以上，Q30值均在93.59%以上。单个碱基位置的测序错误率为0.02%~0.03%，Clean Reads均高于97%（表2）。将皮尔逊系数（R²）作为生物学重复相关性的评估指标，结果表明，生物学重复样品间的R²>0.901（图6）。结果显示测序数据质量和样品间的重复性良好，可以进行下一步分析。

表2 转录组测序数据结果统计

Table 2 Summary of datasets by Illumina sequencing

样品名称 Sample	测序Reads数量 Number of sequencing reads	过滤后Reads Filtered reads	错误率（%） Error rate	Q20（%）	Q30（%）	GC 含量（%） GC content
WT_R1	43540100	42844478	0.02	98.03	94.39	53.12
WT_R2	48380496	47012800	0.03	97.66	93.59	54.42
WT_R3	53115608	51934714	0.02	98.02	94.40	52.83
Zmts1_R1	48947850	47961060	0.02	98.11	94.65	53.97
Zmts1_R2	49695698	48758594	0.02	98.00	94.34	53.82
Zmts1_R3	48102436	47182874	0.02	98.05	94.49	53.65

WT_R1~R3代表野生型籽粒胚乳的3个生物学重复；Zmts1_R1~R3代表突变体籽粒胚乳的3个生物学重复；Q20和Q30分别计算Phred数值大于20和30的碱基占总体碱基的百分比（Clean data）

WT_R1-R3 represents three biological replicates of wild-type grain endosperm； Zmts1_R1-R3 represents three biological repeats of the endosperm of mutant grains；Q20 and Q30 were calculated as the percentage of bases with Phred values greater than 20 and 30， respectively， out of the total number of bases （Clean data）

图6 样本相关性矩阵图

Fig. 6 Correlation matrix among samples

皮尔逊系数R²为生物学重复相关性的评估指标

Pearson coefficient R² was used to evaluate the correlation of biological replicates

将差异基因筛选的标准定义为： |log₂FC|≥1且P-value<0.05，绘制差异表达基因火山图，结果显示，在突变体和野生型玉米样品中，共筛选到1144个差异表达基因，其中表达量升高的基因有571个，表达量下降的基因有573个（图7）。

图7 差异表达基因火山图

Fig. 7 Volcano plot of differentially expressed gene

对1144个差异表达基因进行KEGG功能注释和GO功能富集分析。差异表达基因在3个GO 条目中都超过了20个，差异表达基因多参与ncRNA代谢（ncRNA metabolic process）、碳水化合物生物合成（Carbohydrate biosynthetic process）及tRNA代谢（tRNA metabolic process）等生物过程及核酸结合（Nucleic acid binding）、病毒组装（Virion assembly）和病毒基因组复制（Viral genome replication）等分子功能；参与同源重组（Homologous recombination）、核苷酸切除修复（Nucleotide excision repair）、错配修复（Mismatch repair）等分子功能。KEGG 通路显著性富集分析显示，差异表达基因多参与氨基酸的生物合成，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，半胱氨酸和蛋氨酸代谢等过程（图8）。

图8 差异表达基因的GO和KEGG分析

Fig. 8 GO and KEGG analysis of differentially expressed genes

2.6 qRT-PCR验证

从富集分析结果中挑选出7个与蛋氨酸途径相关基因，利用荧光定量PCR分析其在B73和Zmts1突变体籽粒胚乳中的表达情况，7个差异表达基因包括5个上调基因（Zm00001d050495、Zm00001d034460、Zm00001d008883、Zm00001d049823、Zm00001d018386）和2个下调基因（Zm00001d048060、Zm00001d050133）（图9）。结果表明， 7个差异表达基因在RNA-Seq和qRT-PCR中的表达模式基本是一致的，推测这7个差异表达基因在一定程度上与蛋氨酸的合成存在着联系。

图9 实时荧光定量PCR结果

Fig. 9 Results of quantitative Real-time PCR

***表示在P<0.001水平显著差异

*** indicates significant difference at P<0.001 level

3 讨论

氨基酸是植物氮代谢过程中重要的代谢产物，以游离态、多肽和蛋白质形式存在^［

21］。它是植物中最重要的氮源，对生长发育^{［参考文献 22

百度学术}22］、抗逆^{［参考文献 23

百度学术}23］及代谢都具有重要作用。植物氨基酸代谢路径中，蛋氨酸是富硫氨基酸代谢的关键位点之一，提高作物中蛋氨酸含量主要是通过过表达富含蛋氨酸的贮藏蛋白，减少缺乏蛋氨酸的贮藏蛋白，沉默蛋氨酸分解酶，或者上调参与蛋氨酸合成的关键酶等方法^{［参考文献 24-26}24-26］。如在大豆中引入富硫氨基酸的合成基因，大豆中蛋氨酸和半胱氨酸显著增加^{［参考文献 27

百度学术}27］。在拟南芥中构建突变体降低了苏氨酸合成酶转录水平，蛋氨酸水平显著增多^{［参考文献 6

百度学术}6］。过表达拟南芥胱硫醚-γ-合成酶的马铃薯块茎中蛋氨酸含量是野生型的2倍^{［参考文献 28

百度学术}28］。在拟南芥ts突变体中，蛋氨酸含量较野生型提高了近100倍，这为通过抑制TS基因表达而提高蛋氨酸含量提供了可能。但目前除拟南芥外，在其他植物中通过抑制苏氨酸合成而提高蛋氨酸含量的研究还未见报道。本研究通过对ZmTS1的生物信息学和进化树分析，发现该基因含有一个外显子，共编码527个氨基酸。编码的氨基酸序列与高粱、谷子、水稻、短柄草和拟南芥存在同源关系。本研究通过同源克隆方法克隆ZmTS1基因，并通过提前终止突变体验证基因功能。

在B73和Zmts1突变体中，除茎外，玉米叶和籽粒中，氨基酸总量无显著差异。茎中蛋氨酸含量增加2倍，叶中蛋氨酸含量增加58.33%，玉米籽粒中蛋氨酸含量提高60%。在玉米中叶和籽粒属于联系紧密的库源关系^［

29］，籽粒中蛋氨酸除了本身的蛋氨酸循环途径合成外，也有来自叶片中转运来的蛋氨酸。在Zmts1突变体中，在不影响籽粒氨基酸总量和其他氨基酸含量的情况下，蛋氨酸含量显著提高，推测可能是由于叶中所合成的蛋氨酸转运，直接提高了籽粒蛋氨酸含量；或者蛋氨酸合成的前体物质转运到籽粒中，间接促进蛋氨酸合成使其在籽粒中得到积累。大多数玉米醇溶蛋白中富含谷氨酰胺和脯氨酸，而蛋氨酸和半胱氨酸残基很少，由于编码10 kDa δ-zein的基因存在亲本印迹，很难通过传统育种方式创制高蛋氨酸种质，本研究通过SDS-PAGE分析发现，Zmts1突变体中的10 kDa醇溶蛋白相较于野生型有了显著提高，为高蛋氨酸玉米育种提供了新的思路。

本研究对B73和Zmts1突变体授粉后20 d籽粒胚乳进行转录组分析，通过比较差异表达基因对Zmts1突变体中可能影响蛋氨酸的基因进行分析以完善富硫氨基酸调控网络。共筛选到1144个差异表达基因。GO富集和KEGG通路分析表明，差异表达基因主要参与氨基酸的生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等过程。利用qRT-PCR进一步验证了7个可能参与蛋氨酸代谢途径关键候选基因，RNA-Seq和qRT-PCR的表达模式一致，表明它们直接或间接参与调控蛋氨酸代谢。

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