梅花肉桂醇脱氢酶基因的鉴定和功能分析

刘巳塬; 罗瑜杭; 邓思航; 陈赟; 包菲; LIU Siyuan; LUO Yuhang; DENG Sihang; CHEN Yun; BAO Fei

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刘巳塬
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陈赟
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包菲
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北京林业大学园林学院/花卉种质资源创新与分子育种北京市重点实验室/国家花卉工程技术研究中心/ 城乡生态环境北京实验室，北京100083

最近更新：2025-01-23

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240516001

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摘要

梅花（Prunus mume Siebold & Zucc.）品种丰富，花香香型多样，其中肉桂醇和乙酸肉桂酯是梅花粉色花品种特有的花香成分。在植物体内，肉桂醛在肉桂醇脱氢酶（CAD）的催化下还原生成肉桂醇，肉桂醇又在乙酰转移酶的催化下生成乙酸肉桂酯。因此，肉桂醇不仅是梅花重要的特征花香成分，还是合成乙酸肉桂酯的重要前体。本研究基于梅花二代基因组数据鉴定了56个PmCAD同源基因，发现梅花PmCAD家族成员可分为5个亚组，第I、II和III亚组的蛋白保守基序组成较相似，与第IV和V亚组的差别较大，推测它们之间可能存在功能分化。染色体片段复制和串联复制是PmCAD在基因组中复制进化的两种形式。梅花PmCAD基因启动子区域广泛存在脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸响应元件和分生组织表达相关元件，推测PmCAD基因主要参与梅花的生长发育和抗逆响应。分析与多物种来源CAD蛋白共建树，结果表明位于第III亚组的3个PmCAD可能参与梅花花香合成过程。不同组织器官热图分析表明这3个PmCAD基因都在花器官中表达。基因相对表达量分析发现它们在花开放不同阶段的表达规律不同，在花开放后表达水平较高。体外酶活试验验证了这3个PmCAD都具有肉桂醇脱氢酶活性，因此认为它们共同参与梅花重要花香成分肉桂醇的合成。亚细胞定位分析发现它们在细胞内的分布存在差异，推测它们可能在细胞的不同部位发挥作用。本研究揭示了梅花PmCAD基因的进化和功能分化，为梅花重要花香成分的合成研究奠定了理论基础和为花香分子育种提供了理论依据。

关键词

梅花; 花香; 肉桂醇; CAD; 基因家族; 表达模式; 酶活性

梅花（Prunus mume Siebold & Zucc.）是我国的传统名花，具有悠久的栽培历史和丰富的文化内涵。花香是梅花的重要观赏性状，文人把梅花的花香统称为“暗香”。梅花品种众多，因品种不同香型存在差异。研究发现，梅花的花香类型可能与梅花的花瓣颜色相关：白色的梅花玉碟、绿萼品种群的主要花香成分为乙酸苯甲酯和丁子香酚^［

1］；粉色的梅花朱砂、宫粉品种群的花香成分较丰富，主要包括肉桂醇、乙酸肉桂酯、乙酸苯甲酯和丁子香酚^{［参考文献 2-3}2-3］；而深红色的梅花朱砂品种群的主要花香成分为丁子香酚^{［参考文献 2

百度学术}2，4］。因此，肉桂醇和乙酸肉桂酯是梅花粉色花品种特有的花香成分，研究它们的合成代谢，鉴定其中关键基因，对梅花香花育种有重要意义。

通常认为，肉桂醛在肉桂醇脱氢酶（CAD，cinnamyl alcohol dehydrogenase）的作用下生成肉桂醇，又以肉桂醇为底物可以在酰基转移酶的作用下生成乙酸肉桂酯。肉桂醛大量存在于香料肉桂中，在工业上常以之为原料，用化学方法合成肉桂醇等其他衍生物，并广泛应用于食品、化妆品等香精领域。而在植物体内如何合成芳香化合物肉桂醇、乙酸肉桂酯等研究的不多。肉桂醇脱氢酶广泛存在于植物界，是木质素生物合成过程中的关键酶，催化木质素单体合成的最后一步反应，即肉桂醇脱氢酶可以分别催化芥子醛、松柏醛和香豆醛，生成芥子醇、松柏醇和香豆醇^［

5］。木质素是构成植物细胞壁的重要成分，作为合成植物细胞壁成分的关键酶，肉桂醇脱氢酶广泛分布在各种植物的不同组织中，通常认为肉桂醇脱氢酶可以同时催化多种不同的底物，对于不同的底物亲和性有差异。比如，拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）的AtCAD5可以催化香豆醛、咖啡醛、松柏醛、5-羟基松柏醛和芥子醛5种底物，其中催化香豆醛的活性最高，其次是芥子醛和5-羟基松柏醛。与AtCAD5同源性高达83%的AtCAD4催化活性显著降低，且不能催化芥子醛，而AtCAD1-3和AtCAD6-9催化这5种底物的活性均较低^{［参考文献 6

百度学术}6］。

植物的肉桂醇脱氢酶在进化过程中形成较精细的功能分化。在园艺植物的研究中发现肉桂醇脱氢酶可能参与梨（Pyrus bretschneideri Rehd.）果肉的石细胞形成^［

7］、枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）果实木质化^{［参考文献 8

百度学术}8］、桃（Prunus persica L.）内果皮木质化^{［参考文献 9

百度学术}9］等，以及与黑莓（Rubus fruticosus Pollich）果实的硬度^{［参考文献 10

百度学术}10］、草莓（Fragaria × ananassa Duch.）果实的硬度^{［参考文献 11

百度学术}11］、薄皮甜瓜（Cucumis melo L.）的抗旱能力^{［参考文献 12

百度学术}12］相关。这些园艺表型和抗逆性都与肉桂醇脱氢酶参与木质素合成的功能相关。研究还发现，肉桂醇脱氢酶不仅参与薄皮甜瓜果实木质化过程，而且与果实风味物质肉桂醇合成相关^{［参考文献 13

百度学术}13］。然而，关于肉桂醇脱氢酶在观赏植物花香合成中的功能鲜有报道。本课题组前期研究从梅花粉色品种‘江砂宫粉’和‘粉皮宫粉’的花器官转录组中鉴定了一个肉桂醇脱氢酶PmCAD1基因，并在体外酶反应体系中检测到它可以催化肉桂醛生成肉桂醇，推测它可能是影响梅花花香成分肉桂醇合成的重要基因^{［参考文献 14

百度学术}14］。但是，肉桂醇脱氢酶在梅花基因组中的进化关系，以及是否还有其他CAD基因参与梅花的花香成分肉桂醇的合成还不清楚。本研究基于梅花二代基因组数据^{［参考文献 15

百度学术}15］，在梅花全基因组检索获得PmCAD同源基因，进一步开展编码蛋白的理化性质、亚细胞定位预测、基因结构、保守结构域、染色体定位、染色体共线性、顺式作用元件、系统发育进化、表达热图等生物信息学分析，并筛选出3个花香合成相关的PmCAD基因，进一步通过实时荧光定量PCR技术分析其花开放不同阶段的表达模式，并通过体外酶活体系分析梅花PmCAD蛋白的酶活性，最后用烟草叶片瞬时表达的方法对梅花PmCAD蛋白进行亚细胞定位。本研究鉴定了3个梅花特征花香成分肉桂醇合成相关的酶基因，为梅花香花分子育种奠定了理论基础和提供了优异基因储备。

1 材料与方法

1.1 梅花PmCAD基因家族的全基因组鉴定及生物信息学分析

利用梅花二代基因组数据库^［

15］（数据已上传NCBI，项目号PRJNA171605），以拟南芥AtCAD5的氨基酸序列作为参考序列执行本地BlastP搜索比对，筛选条件为E值≤1×10^-5，获得梅花PmCAD家族成员的基因序列。利用ExPASy-ProtParam（https：//www.expasy.org/resources/protparam/）网站在线计算梅花PmCAD蛋白的氨基酸数目、亲水性和分子量等基本理化性质。利用GenScript网站中的WoLFPSORT工具（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）在线预测PmCAD蛋白的亚细胞定位。整理PmCAD基因的CDS序列和基因序列，利用GSDS2.0网站（gsds.gao-lab.org）在线绘制梅花PmCAD基因结构图。利用MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）在线预测PmCAD蛋白质基序，并进行保守结构域比对。在Tbtools^{［参考文献 16

百度学术}16］中进行domains和motif可视化。基于梅花二代基因组的fasta序列及基因注释GFF3文件，利用Tbtools对梅花PmCAD基因进行染色体定位和共线性分析，并在线绘制circos图。运用Tbtools软件提取梅花PmCAD基因起始密码子ATG上游2000 bp序列为启动子序列，利用PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线预测梅花PmCAD基因启动子的顺式作用元件，筛选后在Tbtools软件中进行顺式作用元件的可视化。

1.2 梅花PmCAD家族成员系统发育树分析

在NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在线提取杨树（Populus alba L.） PaCAD1 （XP_034919559.1）、PaCAD2 （XP_034903675.1）、PaCAD3 （XP_034903674.1）、PaCAD4 （XP_034903673.1），葡萄（Vitis vinifera L.） VvCAD1 （XP_002283356.1）、VvCAD2 （XP_002279718.1），水稻（Oryza sativa L.） OsCAD1 （NP_001406095.1）、OsCAD2 （XP_015612799.1），拟南芥AtCAD1 （NP_177412.1）、AtCAD2 （NP_179765.1）、AtCAD3 （NP_179780.1）、AtCAD4 （NP_188576.1）、AtCAD5 （NP_195149.1）、AtCAD6 （NP_195510.1）、AtCAD7 （NP_195511.1）、AtCAD8 （NP_195512.1）、AtCAD9 （NP_195643.1）、ADH1 （NP_177837.1）、ADH2 （NP_001190468.1）、AOR1 （NP_173786.1）、HCS1 （NP_001324828.1）、HER2 （NP_851257.1）、AtSDH （NP_974925.1）和草莓FxaCAD1 （AAD10327.1）、FxaCAD2 （AAK28509.1）、FxaCAD3 （AFQ36034.1）等物种的肉桂醇脱氢酶氨基酸序列。运用Clustal X 2.0对梅花PmCAD和已报道的其他物种的肉桂醇脱氢酶蛋白进行多序列比对。利用MEGA7.0软件的邻接法进行分子演化树的构建。根据已有的梅花根、茎、叶、花、果的转录组数据（数据已上传NCBI，项目号PRJNA172987），从中提取梅花PmCAD基因表达的RPKM值，将数据进行log₁₀对数处理后用联川生物云平台（https：//www.omicstudio.cn/）绘制热图，并进行聚类分析。

1.3 梅花PmCAD基因在不同开花阶段表达模式分析

以梅花‘江砂宫粉’为试验品种，采集于北京鹫峰国家森林公园梅花资源圃。于同日上午9：00-10：00采集‘江砂宫粉’花蕾期、初花期、盛花期、末花期的花朵数朵，剥离花瓣后用锡纸包住，迅速置于液氮中速冻，并保存于-80 ℃超低温冰箱，用于基因表达分析。使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒［DP441，天根生化科技（北京）有限公司］提取梅花花瓣总RNA，使用FastKing cDNA第一链合成试剂盒（去基因组）［KR116，天根生化科技（北京）有限公司］反转录成cDNA，用于基因相对表达量分析和基因克隆。根据PmCAD基因的CDS序列设计荧光定量引物（表1），以梅花PmPP2A或烟草（Nicotiana tabacum L.）的NbTublin基因作为内参基因，每个时期的样品设置4次重复，利用2^-ΔΔCt法对数据进行处理，计算其相对表达量。qRT-PCR扩增体系为15μL，包含：cDNA 2 µL（2μg RNA反转录cDNA后稀释10倍使用），正、反向引物各0.2 μL（10 µmol/L），SYBR Premix Ex TaqⅡ预混液7.5 µL，加水补足15 µL。扩增程序为：预变性（95 ℃ 30 s）；循环45个（95 ℃ 5s，60 ℃ 34s）；最后进行熔解曲线分析。

表1 qRT-PCR引物序列

Table 1 Sequence of qRT-PCR primers

引物名称 Primer name	正向序列（5′-3′） Forword sequence（5′-3′）	反向序列（5′-3′） Reverse sequence（5′-3′）
Pm021215	CCAAGTTCAGAGTAGGAGAT	CGGAATAAGTGTCATTGTAAGA
Pm021214	TTGCCACACTGATACTCA	CGTCTCCTACTCTGAACTT
Pm002468	GGAGAAGTGGTGGAGTTG	ATTGGCAAGACAGGCATT
PmPP2A	ATGCCGGCTCACGCGGATCTG	TTACAAAAAATAATCTGGAGTC
NbTublin	CCAGGTGACAAGACAGTT	AATGACAGTAGGCTCAAGAT

1.4 梅花PmCAD体外酶活性检测

以梅花‘江砂宫粉’的花的cDNA为模板，使用试剂盒KOD-Plus-Neo（KOD-401，Toyobo）PCR扩增PmCAD编码序列，克隆引物见表2。PCR反应体系50 μL，包含如下组分：10×buffer 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，25 mmol/L MgSO₄ 3 μL，10 μmol/L正反向克隆引物各1.5μL，模板cDNA 4 μL（约200 ng），KOD酶1 μL，加水补足50 μL。扩增程序为：预变性（94 ℃ 2 min）；循环25个（98 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s）；延伸（68 ℃ 1 min）。使用试剂盒In-Fusion HD Cloning Kit（PT5162-1，Clontech）将切胶回收的PmCAD基因片段与植物过量表达载体pSuper1300-GFP连接（载体线性化用限制性内切酶SpeI），Sanger测序确定片段无误后，将构建好的PmCAD-pSuper1300-GFP的载体质粒分别转化农杆菌GV3101，并通过农杆菌介导的方法瞬时转化烟草叶片，转化液包括10 mmol/L MES （pH5.7）、10 mmol/L MgCl₂、150 μmol/L 乙酰丁香酮，用于悬浮农杆菌（农杆菌浓度：目的基因OD₆₀₀为0.5，P19为0.2），72 h后提取烟草叶片总蛋白用于体外酶活性检测，以转化空载的烟草叶片作为负对照。

表2 基因克隆引物序列

Table 2 Gene clone primers sequence

引物名称

Primer name

正向序列（5′-3′）

Forword sequence（5′-3′）

反向序列（5′-3′）

Reverse sequence（5′-3′）

Pm021215

GTCGACATTTAAATACTAGTATGGGTAGCCTTGAAGTGGA

ATGGTACCGGATCCACTAGTTGGATTAAGATTGCTGCCGG

Pm021214

GTCGACATTTAAATACTAGTATGAGGAATGAGATTCACAA

ATGGTACCGGATCCACTAGTTTCCAGGTTACTGCCAGCTA

Pm002468

GTCGACATTTAAATACTAGTATGGTTAGCCTTGAGGTGGA

ATGGTACCGGATCCACTAGTTTGATGAAGATTGCTGGCAG

肉桂醇脱氢酶酶活性检测的原理是反应底物NADPH在340 nm的光下有特异的吸收峰，通过检测酶反应前后吸光值的变化可以计算底物的消耗速度，进而换算成酶活性。酶活性检测采用200 μL的体外酶反应体系，包括：20 mmol/L MES （pH5.7）、1 mmol/L肉桂醛、1 mmol/L NADPH和20 μg叶片提取蛋白。用酶标仪检测340 nm下的吸光值，体外反应温度为30 ℃，检测时间为30 min。最后通过0 min和30 min吸光值的变化计算肉桂醇脱氢酶酶活，公式为：CAD酶活（U/μg）=△A/（ε×d）×10⁹/M/T，其中△A：0 min和30 min吸光值差值；ε：NADPH摩尔消光系数，为6.22×10³ L/（mol·cm）；d：光径，为1 cm；10⁹：单位换算系数，1 mol=10⁹ nmol；M：蛋白的质量（单位为μg）；T：反应时间（单位为min）。

2 结果与分析

2.1 梅花PmCAD基因家族成员的鉴定及各成员理化性质分析

通过梅花全基因组搜索，共鉴定出56个梅花PmCAD基因家族成员（表3）。蛋白序列一级结构的理化性质分析显示，这56个PmCAD蛋白长度为118~802个氨基酸，其中Pm022689的蛋白序列最长，Pm001767和Pm002267的蛋白序列短于其他成员；分子量介于12.86~89.25 kDa之间，等电点范围为5.05~9.52，其中40个PmCAD蛋白的理论等电点处于酸性区间内，16个PmCAD蛋白的理论等电点处于碱性范围内，表明PmCAD蛋白质酸碱分布极不均匀，表现为酸性的蛋白占比大；亲水性平均值在-0.702~0.291之间，其中亲水性PmCAD蛋白有36个，疏水性PmCAD蛋白有20个；不稳定系数范围为12.11~105.76，其中48个PmCAD蛋白的不稳定系数值小于40，为相对稳定蛋白质。亚细胞定位预测显示，40个PmCAD蛋白位于细胞质中，占比71％，12个位于叶绿体，2个位于细胞骨架，1个位于液泡，1个位于过氧化物酶体上。

表3 梅花PmCAD家族成员信息

Table 3 Information of PmCAD family in P.mume

基因ID Gene ID	登录号 Accession number	氨基酸数目（aa） Number of amino acids	分子量（kD） Molecular weight	等电点 Isoelectric point	不稳定系数 The instability index	亲水性均值 Gravy	亚细胞定位 Subcellular localization
Pm021215	XP_008236378.1	359	38.92	5.43	24.47	-0.028	细胞质
Pm021214	XP_008236377.1	388	42.41	5.73	26.28	-0.029	细胞质
Pm002468	XP_008238749.1	334	36.32	5.47	34.39	0.026	叶绿体
Pm002257	XP_008236481.1	392	42.60	5.96	86.76	-0.013	细胞质
Pm002259	XP_008236502.1	360	38.75	7.14	32.32	0.022	细胞质
Pm002246	XP_008236420.1	363	39.24	6.50	30.74	0.015	细胞质
Pm002258	XP_008236492.1	361	38.87	6.50	31.46	0.053	细胞质
Pm001694	XP_008231559.1	267	38.32	6.75	65.81	-0.702	细胞质
Pm002261	XP_008236513.1	361	38.96	6.39	31.48	0.042	细胞质
Pm002254	XP_008236460.1	360	39.02	6.50	23.99	-0.003	细胞质
Pm002255	XP_008236471.1	364	39.39	5.86	31.06	-0.072	细胞质
Pm002247	XP_008237214.1	366	39.24	6.31	33.95	0.055	叶绿体
Pm002264	XP_008236534.1	361	38.66	6.51	29.82	0.054	细胞质
Pm002266	XP_008236562.1	362	38.71	6.23	25.13	0.046	细胞质
Pm002250	XP_008236492.1	362	39.45	5.95	22.90	0.032	细胞质
Pm002263	XP_008236524.1	361	38.53	6.71	27.46	0.101	细胞质
Pm006164	XP_008221221.1	361	39.38	6.73	26.61	-0.073	过氧化物酶体
Pm002265	XP_008236551.1	363	39.02	6.39	21.86	0.074	细胞质
Pm024279	XP_016651112.1	362	39.38	6.39	34.03	-0.094	细胞质
Pm014932	XP_008229770.1	340	36.49	6.59	31.64	0.049	细胞骨架
Pm002252	XP_008236513.1	258	28.20	9.28	40.24	-0.050	叶绿体
Pm010608	XP_016648186.1	217	23.47	9.40	30.06	0.174	叶绿体
Pm001767	XP_016647223.1	119	13.09	6.07	12.11	0.219	细胞质
Pm002267	XP_008237261.2	118	12.86	6.90	105.76	0.164	细胞质
Pm024278	XP_016651112.1	230	25.18	5.51	34.47	-0.188	细胞质
Pm001691	XP_008231559.1	348	39.44	6.51	41.01	-0.243	叶绿体
Pm012776	XP_008227684.1	609	65.57	8.38	48.08	0.030	叶绿体
Pm019393	XP_008234305.1	367	39.24	6.46	23.96	0.116	细胞质
Pm020413	XP_008235523.1	711	77.36	6.20	31.73	-0.039	细胞质
Pm006116	XP_008221166.1	389	42.40	5.34	36.33	0.066	细胞质
Pm021179	XP_008236330.1	371	39.70	6.79	25.34	0.058	细胞质
Pm021180	XP_008236330.1	371	39.78	6.56	25.81	0.043	细胞质
Pm024263	XP_008239269.1	395	42.88	6.40	24.31	-0.118	细胞质
Pm022682	XP_008237683.1	379	41.22	5.98	34.85	-0.116	细胞质
Pm004008	XP_016651112.1	163	17.62	5.50	21.94	-0.133	细胞质
Pm022684	XP_008237684.1	379	41.18	5.92	35.37	-0.110	细胞质
Pm006677	XP_008221813.1	393	41.80	8.74	23.52	0.008	叶绿体
Pm004006	XP_016648186.1	255	27.91	8.87	31.42	0.291	叶绿体
Pm020469	XP_008235567.1	405	43.25	7.49	28.62	0.092	液泡
Pm022687	XP_008237686.1	382	41.45	6.33	28.26	-0.065	细胞质
Pm025214	XP_008240325.1	699	75.99	5.05	44.03	0.062	细胞质
Pm019578	XP_008234855.1	362	38.92	8.14	35.61	0.024	细胞质
Pm015711	XP_008230609.1	329	34.74	9.42	22.74	-0.030	细胞质
Pm029864	XP_008244673.1	321	34.16	8.30	27.73	0.088	细胞骨架
Pm015719	XP_008230614.1	323	34.46	5.81	22.53	0.077	叶绿体
Pm029868	XP_008244675.1	330	34.86	9.52	19.84	0.087	细胞质
Pm015714	XP_008230611.1	322	34.32	6.17	22.22	0.007	细胞质
Pm015717	XP_008230612.1	323	34.31	5.61	23.03	0.079	叶绿体
Pm029863	XP_008244672.1	333	34.76	9.17	28.97	-0.042	细胞质
Pm029866	XP_008244674.1	332	35.06	7.69	29.04	0.032	细胞质
Pm022689	XP_008237687.1	802	89.25	5.59	38.82	-0.134	叶绿体
Pm020292	XP_008235420.1	329	34.53	9.19	22.87	0.003	细胞质
Pm029865	XP_008244675.1	302	31.55	9.29	22.86	0.029	细胞质
Pm009933	XP_008224971.1	326	34.97	6.17	43.67	0.136	细胞质
Pm015712	XP_008230610.1	325	34.65	5.73	25.75	0.091	叶绿体
Pm015713	XP_008230947.1	323	34.48	8.42	23.26	0.048	细胞质

2.2 梅花PmCAD基因家族成员的基因结构、保守基序及保守结构域分析

为了更好地展示梅花PmCAD基因家族成员之间的进化关系，运用生物信息学的方法分析各成员基因结构、蛋白保守基序和保守结构域的差异（图1）。进化树分析表明，梅花PmCAD基因家族可以分为5个亚组（图1A）。基于梅花基因组数据得到梅花PmCAD基因家族各成员的基因结构（图1B），外显子和内含子的基因结构可以从核酸上反映基因的进化特征，梅花PmCAD基因均具备完整的基因结构，家族基因成员在结构上存在较明显的差异。PmCAD基因家族成员中外显子数量最多为10个，包括基因Pm006116、Pm020413、Pm022682、Pm022684、Pm022687、Pm024263和Pm025214；而Pm001691基因有且仅有1个外显子，不含内含子。基因结构上的差异表明梅花PmCAD基因家族成员间存在进化的多样性，可能存在较大的功能分化。

图1 梅花PmCAD的系统发育关系、基因结构、保守基序和结构域

Fig. 1 Phylogenetic relationships，gene structures， architectures of conserved protein motifs and conserved domains in PmCAD

A：梅花PmCAD系统发育树； B：梅花PmCAD基因结构，底部刻度线用来估计DNA长度； C：梅花PmCAD的保守基序组成，底部刻度线用来估计蛋白质长度； D：梅花PmCAD的保守结构域，底部刻度线用来估计蛋白质长度

A：Phylogenetic relationship of PmCAD； B： The gene structures of PmCAD， the bottom scale line is used to estimate the length of the DNA； C： The motif compositions of PmCAD， the bottom scale line is used to estimate the length of the proteins； D： Conserved domains of PmCAD， the bottom scale line is used to estimate the length of the proteins

进一步分析梅花PmCAD基因家族的蛋白保守基序和结构域。如图1所示，处于同一亚组的PmCAD家族成员有相对较相似的保守基序（Motif）（图1C）和保守结构域（图1D）。第I、II、III亚组的成员基序的组成较相似，而第IV和V亚组成员的保守基序组成与前3个亚组的保守基序组成差异较大，表明它们的生物功能可能存在明显的差异。其中，第IV亚组的成员都含有较独特的Motif 9，而第V亚组的成员含有的基序类型较少，主要有基序Motif 2、Motif 4、Motif 5和Motif 7。从保守结构域的分布上看，第I亚组的成员主要含有PLN02586结构域，预测具有肉桂醇脱氢酶活性；第II亚组的成员主要含有MDR结构域，预测具有锌离子依赖的中链脱氢酶活性；第III亚组的成员大多具有肉桂醇脱氢酶家族特有的PLN02514结构域，属于典型的肉桂醇脱氢酶；第IV亚组的成员主要含有类MDR结构域；第V亚组的成员含有的保守结构域类型较多，其中主要为醇类脱氢酶特有的alcohol_DH结构域。以上结果说明梅花PmCAD基因家族成员在进化过程中可能发生了较为系统的功能分化。

2.3 梅花PmCAD基因在染色体上的分布及共线性分析

对梅花PmCAD基因进行染色体定位分析，发现51个PmCAD基因在梅花Pm1到Pm7染色体上都有分布（图2），另有5个PmCAD基因成簇分布在scaffold371上（图2中未显示）。除了散状分布外，在Pm1、Pm4、Pm6、Pm7染色体都有成簇基因分布，这表明梅花PmCAD基因在基因组中的复制存在片段复制和串联复制两种形式，并且串联复制是梅花PmCAD基因复制的重要形式。梅花PmCAD基因染色体共线性分析表明，在梅花Pm2和Pm4染色体，以及Pm1和Pm6染色体上片段的交换复制导致梅花PmCAD基因Pm00667和Pm015711之间以及Pm002468和Pm021214之间发生基因复制。

图2 梅花PmCAD基因染色体定位和共线性关系

Fig. 2 Chromosome locations and synteny relationship of PmCAD genes

2.4 PmCAD基因的启动子顺式作用元件分析

进一步从基因的表达调控方面解析梅花PmCAD基因家族成员的功能分化，利用PlantCARE在线网站对梅花PmCAD基因的启动子序列进行分析，发现在梅花PmCAD基因的启动子区域广泛存在4类顺式作用元件，包括参与脱落酸响应、茉莉酸甲酯响应、水杨酸响应和分生组织表达相关的顺式作用元件（图3），这说明梅花PmCAD基因家族成员主要参与植物的生长发育和逆境响应。其中参与茉莉酸甲酯和脱落酸响应的顺式作用元件在PmCAD基因中占比最多，推测这些PmCAD基因在梅花抵抗生物或非生物胁迫过程中发挥重要作用。

图3 梅花PmCAD基因启动子区域顺式作用元件分析

Fig. 3 Cis-acting elements in the promoter regions of PmCAD genes

2.5 梅花PmCAD家族与其他物种肉桂醇脱氢酶的系统进化树分析

为预测梅花PmCAD家族成员可能的生物学功能，选择拟南芥、水稻、白杨、草莓和葡萄中已报道的肉桂醇脱氢酶蛋白与梅花PmCAD蛋白一起构建系统发育树（图4）。根据系统发育树的分支关系，将梅花PmCAD家族成员分为5个亚组，第Ⅰ亚组中还包含草莓FxaCAD1、FxaCAD2、FxaCAD3、拟南芥AtCAD6、AtCAD7、AtCAD8和葡萄VvCAD2等；第Ⅱ亚组中包含拟南芥AtCAD1等；第Ⅲ亚组包含拟南芥AtCAD4、AtCAD5和葡萄VvCAD1；第Ⅳ亚组包含拟南芥氧化还原酶AtAOR，它编码一个NADPH依赖的烯醛/酮氧化还原酶，参与植物叶绿体光合作用产生的活性羰基的清除^［

17］；第Ⅴ亚组包含醇脱氢酶AtADHs和山梨醇脱氢酶AtSDH等。已有研究报道，拟南芥AtCAD4和AtCAD5催化香豆醛、咖啡醛、松柏醛、5-羟基松柏醛和芥子醛还原成相应醇的活性较高，而AtCAD1-3和AtCAD6-9催化这些底物的活性较低^{［参考文献 5

百度学术}5］。基于以上分析推测位于第Ⅲ亚组的梅花PmCAD，包括Pm021215、Pm021214和Pm002468，它们可能与梅花花香化合物肉桂醇的合成相关。梅花的花、果、根、茎、叶不同组织器官的转录热图分析也表明位于第Ⅲ亚组的3个PmCAD基因可以在花器官中表达，其中Pm021215和Pm021214在各个器官中的表达水平都较高，而Pm002468在根中的表达量最高，其次是花和果，在茎中表达量最低。因此选择这3个基因作为梅花花香合成相关肉桂醇脱氢酶候选基因进行下一步的研究。

图4 PmCAD与其他物种同源序列的系统进化树及在梅花不同组织器官中的表达热图分析

Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of PmCAD and homologous sequences in other species and heat map analysis of expression in different tissues and organs of P. mume

Pm：梅花； At：拟南芥； Os：水稻； Pa：白杨； Fxa：草莓； Vv：葡萄

Pm：Prunus mume； At：Arabidopsis thaliana； Os：Oryza sativa； Pa：Populus alba； Fxa：Fragaria × ananassa； Vv： Vitis vinifera

2.6 PmCAD基因的时空表达模式分析和酶活性检测

在梅花的花期采集花蕾期、初花期、盛花期和末花期的花朵（图5A），分离花瓣用于基因表达模式分析。实时荧光定量PCR结果显示，Pm021215和Pm021214在花朵开放过程中呈现先升高后降低的表达模式，其中Pm021215在盛花期表达水平达到峰值（图5B），而Pm021214在初花期表达水平达到峰值（图5C）；Pm002468的表达水平在花朵开放过程中呈现持续升高的趋势，在末花期表达水平达到峰值（图5D）。进一步克隆梅花‘江砂宫粉’的PmCAD基因（图5E），其中Pm021215的CDS为1074 bp，Pm021214的CDS为1074 bp，而Pm002468的CDS为912 bp。构建了梅花PmCAD基因与35S启动子连接的植物过量表达载体，通过农杆菌注射的方法在烟草叶片中瞬时表达PmCAD，如图5F~H所示，PmCAD基因在烟草叶片中均过量表达。提取烟草叶片粗蛋白，在体外酶反应体系中验证了这3个候选PmCAD的酶活性，如图5I所示，以空载为阴性对照，梅花Pm021215、Pm021214和Pm002468 都表现较高的将肉桂醛转化为肉桂醇的酶活性。结合基因表达规律和酶活性的研究，认为Pm021215、Pm002468和Pm021214都参与梅花宫粉品种群特征花香成分肉桂醇的合成。

图5 ‘江砂宫粉’不同开花阶段候选PmCAD基因表达分析及酶活性检测

Fig. 5 The candidate PmCAD genes relative expression analysis at different flowering stages of P. mume ‘Jiangsha Gongfen’ and enzyme activity analysis

A：梅花‘江砂宫粉’不同开花阶段；B~D： PmCAD基因在花开放不同阶段的表达分析；E：梅花PmCAD基因的扩增； M：分子大小指示带； 1： Pm021215； 2： Pm021214； 3： Pm002468； F~H： PmCAD基因在烟草叶片中的表达量分析，以Nbtublin作为内参基因； I： PmCAD肉桂醇脱氢酶活性分析； *：在P<0.05水平上达到显著水平；**：在P<0.01水平上达到极显著水平

A： Different flowering stages of P. mume ‘Jiangsha Gongfen’； B-D： PmCAD genes relative expression analysis at different flowering stages； E： Amplification of PmCAD genes in P. mume； M： Marker； 1： Pm021215； 2： Pm021214； 3： Pm002468； F-H： Expression level analysis of PmCAD gene in tobacco leaves， with Nbtubulin as an internal reference gene； I： PmCAD cinnamyl alcohol dehydrogenase activity analysis； *： Reached a significant level at P<0.05 level；**： Reached a highly significant level at P<0.01 level

2.7 PmCAD的亚细胞定位

蛋白的亚细胞定位对大分子酶的生物功能的正常执行起重要的作用。针对鉴定获得的3个具有肉桂醇脱氢酶活性的PmCAD蛋白进行了亚细胞定位。如图6所示，Pm021215和Pm021214主要定位在细胞质中，其中Pm021214在细胞核中也观察到信号；Pm002468蛋白在细胞中呈网状分布，推测它可能定位于内质网中，此外它在细胞核中也有分布。Pm021215、Pm002468和Pm021214亚细胞定位的差异表明它们在细胞的不同区域发挥作用，可能参与不同的代谢过程。

图6 PmCAD 蛋白的亚细胞定位分析

Fig. 6 Subcellular localization analysis of PmCAD protein

3 讨论

花香是梅花的重要观赏性状，肉桂醇是梅花宫粉品种群的主要特征花香成分。本研究聚焦梅花花香成分肉桂醇的合成代谢研究，从梅花全基因组中共鉴定了56个梅花PmCAD家族成员，蛋白理化性质、基因结构和蛋白保守基序分析都表明梅花PmCAD家族成员间可能存在较大的功能分化。染色体定位及共线性分析发现梅花PmCAD家族成员在进化过程中发生了包括染色体片段的交换复制和串联复制。对于本研究鉴定的3个花香成分肉桂醇合成相关PmCAD基因，其中Pm021214和Pm021215之间通过串联复制产生，位于第1号染色体；而Pm002468为Pm021214通过染色体片段复制产生，分别位于第1号染色体和第6号染色体。通过启动子顺式作用元件分析，推测梅花PmCAD基因主要参与生长发育和抗逆响应，这与其在植物中保守的木质素合成功能是相一致的。虽然Pm002468和Pm021214是通过染色体片段复制产生，但是它们的启动子顺式元件类型差别较大，两者仅有1个相同的参与水杨酸响应的元件，说明Pm002468和Pm021214复制事件发生后基因的启动子又发生了新进化，启动子的进化可能进一步推动基因的功能发生分化。

依据进化发育树关系和不同组织器官表达热图分析，本研究中3个PmCAD （Pm021215、Pm021214、Pm002468）可能与花香成分肉桂醇合成相关。其中Pm021215为本课题组前期通过转录组鉴定的PmCAD1，它催化肉桂醛生成肉桂醇的功能已被验证，Pm021214为PmCAD2，之前的研究未检测出其具有催化肉桂醛生成肉桂醇的活性^［

12］。而本研究对体外酶反应体系中的底物浓度和检测手段进行优化后，证明Pm021215、Pm021214和Pm002468都具有催化肉桂醛生成肉桂醇的活性。梅和桃同属蔷薇科李属植物，和桃花比较，梅花具有典型的特征花香，课题组前期通过比较梅和桃的基因组，发现梅花基因组中PmBEAT基因的串联复制最终导致梅花能够合成特征花香成分乙酸苯甲酯^{［参考文献 18

百度学术}18］。运用比较基因组的方法，将梅和桃基因组中筛选到的肉桂醇脱氢酶共建进化发育树，发现梅和桃的肉桂醇脱氢酶在进化树中呈较均匀分布，没有发现梅花中存在特殊的分支，并且梅花的Pm021215、Pm021214和Pm002468基因在桃基因组中都各有一个对应的旁系同源基因，这说明梅花基因组中可能不存在额外的、特异作用于花香成分肉桂醇合成的CAD基因，推测梅花的花香成分肉桂醇的合成可能与木质素的合成共用一套CAD基因。

实时荧光定量PCR分析表明这3个基因在开花的各个阶段都表达，且表达模式有差异，其中Pm021214在初花期表达量较高，Pm021215在盛花期表达量较高，而Pm002468在末花期表达量较高。鉴于它们都可以在花开放过程中表达，且都具有较高的肉桂醇脱氢酶活性，推测它们共同参与了梅花宫粉品种群特征花香成分肉桂醇的合成。生物信息学预测Pm021215和Pm021214定位于细胞质，Pm002468定位于叶绿体中，但是试验验证的结果发现Pm021215和Pm021214主要定位于细胞质，而Pm002468可能定位于内质网中，并且Pm021214和Pm002468在细胞核中也有分布。亚细胞定位存在差异，说明它们在细胞不同的区域可能参与不同的代谢过程。已有研究报道拟南芥AtCAD5定位在细胞壁和细胞质中，与其细胞壁合成的功能是相一致^［

19］。Pm021215、Pm021214和Pm002468是否定位在细胞壁上，以及Pm002468更精细的亚细胞定位需要进一步设计试验加以确认。

综合生物信息学分析和试验验证，梅花Pm021215、Pm021214和Pm002468基因可能同时在木质素合成和花香成分肉桂醇的合成上都发挥作用。综上所述，本研究分析了梅花PmCAD家族成员的进化关系，并在已有的研究基础上重新鉴定了2个新的可能参与梅花花香合成的PmCAD基因（Pm021214和Pm002468），为梅花特征花香成分肉桂醇的合成研究奠定基础，为梅花特色品种特征花香分子育种提供优异的基因储备。

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