宁夏枸杞<bold>LbALDH3F1</bold>基因克隆及耐盐性分析

马小霞; 胡进红; 梁旺利; 麻玉荣; 孙雯; 王玲霞; 秦垦; 梁文裕; MA Xiaoxia; HU Jinhong; LIANG Wangli; MA Yurong; SUN Wen; WANG Lingxia; QIN Ken; LIANG Wenyu

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宁夏枸杞LbALDH3F1基因克隆及耐盐性分析 PDF

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梁文裕 ^1,2
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1. 宁夏大学生命科学学院，银川750021； 2. 林木资源高效生产全国重点实验室，银川750021； 3. 宁夏农林科学院，银川750002

最近更新：2025-01-23

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240517001

摘要

宁夏枸杞为著名耐盐药用植物，本研究以宁夏枸杞为材料，采用RACE方法克隆LbALDH3F1基因并进行序列分析，PCR法克隆LbALDH3F1基因启动子序列，构建过表达载体pCAMBIA 2300 EGFP- LbALDH3F1进行拟南芥遗传转化和亚细胞定位，并进行转LbALDH3F1拟南芥耐NaCl胁迫检验及PCR鉴定。结果表明，宁夏枸杞LbALDH3F1基因全长1700 bp，编码序列为1446 bp，编码481个氨基酸残基；上游启动子序列为1850 bp；LbALDH3F1二级结构以 α 螺旋和无规则卷曲为主，定位于细胞核和细胞膜中。随着NaCl胁迫程度加深，宁夏枸杞的LbALDH3F1表达量呈先升后降的趋势，且在200 mmol/L NaCl胁迫时表达量最高。对LbALDH3F1进行遗传转化，发现转基因拟南芥对NaCl胁迫的耐受能力明显增强，超氧化物歧化酶表现出更高的活性，脯氨酸及叶绿素a含量在300 mmol/L NaCl胁迫下显著升高，而过氧化氢及丙二醛等含量在高盐胁迫下显著低于野生型拟南芥，表明LbALDH3F1具有提高植物抗氧化能力从而增强耐NaCl胁迫的能力。该研究结果为深入探讨宁夏枸杞LbALDH3F1基因功能及其在响应盐胁迫过程中的应答机制奠定了基础。

关键词

LbALDH3F1; 克隆; 遗传转化; 盐胁迫; 基因功能; 宁夏枸杞

盐碱胁迫等逆境胁迫因子会影响植物的生长发育，使细胞内产生大量的活性氧（ROS，reactive oxygen species）^［

1］，打破ROS稳态使膜脂过氧化，进而产生相应的醛类物质，醛的过度积累会破坏蛋白质和核酸的正常结构及功能^{［参考文献 2-3}2-3］。为降低活性氧的毒害作用，植物体内会诱导醛脱氢酶（ALDHs，aldehyde dehydrogenases）基因的表达。ALDHs是一类NAD（P）⁺依赖型酶的基因超家族，能催化多种内源性及外源性芳香族与脂肪族醛的不可逆氧化^{［参考文献 4

百度学术}4］，参与脂质过氧化释放的醛产物的解毒，将醛类物质转化为无毒的羧酸，并降低脂质过氧化，提高植物对逆境的耐受性，从而调节植物体内醛类物质的动态平衡^{［参考文献 5-6}5-6］。ALDHs在植物响应逆境胁迫中发挥重要作用^{［参考文献 7-9}7-9］，棉花中大多数Ga-ALDHs和Gh-ALDHs在高盐和干旱等胁迫条件下上调表达^{［参考文献 10

百度学术}10］，油桐（Vernicia fordii （Hemsl.） Airy Shaw）中的ALDH2B4、ALDH3H1基因也受盐胁迫、干旱胁迫及ABA诱导表达^{［参考文献 11

百度学术}11］。研究发现，过表达At-ALDH3的转基因拟南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）与野生型植株相比具有更强的耐盐性，其原因主要与脂质过氧化产生的反应性醛类物质的积累减少相关^{［参考文献 12

百度学术}12］。此外，对转ALDH3I1基因的烟草植株进行盐胁迫，发现与野生型相比，转基因植株的ALDH3I1转录水平升高，对盐和氧化胁迫等耐受性增强，可通过积累脯氨酸和叶绿素使植株具有非生物胁迫耐受性，以及降低ROS和丙二醛（MDA，malondialdehyde）水平来降低氧化胁迫，从而提高转基因植株的抗逆性^{［参考文献 13

百度学术}13］。因此，ALDHs在参与植物逆境胁迫应答过程中具有非常重要的作用，其参与的生物学过程及其调控功能需进一步研究。

宁夏枸杞（Lycium barbarum）为茄科枸杞属的多年生落叶灌木，广泛分布于我国西北部地区，是典型的耐盐碱药用植物和园艺植物。长期的盐生环境使宁夏枸杞进化出了一系列适应盐胁迫的机制，包括离子选择性吸收^［

14］、渗透调节物质积累^{［参考文献 15

百度学术}15］、活性氧自由基清除等^{［参考文献 16

百度学术}16］。目前越来越多的研究表明宁夏枸杞可通过形态结构、生理生化及分子水平等方面的变化协同适应盐胁迫，如NaCl浓度大于200 mmol/L时，宁夏枸杞叶片和幼根细胞的显微及超微结构发生明显变化，且叶肉细胞中线粒体的变化没有叶绿体的变化显著^{［参考文献 17

百度学术}17］。随着NaCl胁迫时间的延长和浓度的增加，编码质膜和液泡膜的Na⁺/H⁺转运蛋白基因LbSOS1和LbNHX1、液泡膜H⁺-ATPase基因LbVHA-C1和质膜H⁺-ATPase基因LbHA1的表达水平均降低，而Na⁺积累量大幅增加，致使枸杞抗盐性降低^{［参考文献 18

百度学术}18］。本课题组前期研究发现宁夏枸杞ALDH3F1在不同浓度NaCl胁迫（0、100、200、300 mmol/L）下差异表达^{［参考文献 19

百度学术}19］，而宁夏枸杞ALDH3F1的分子信息及调控机制尚不明确。因此，本研究以宁夏枸杞为材料，利用RACE技术克隆LbALDH3F1基因，PCR法克隆LbALDH3F1基因启动子序列，对LbALDH3F1进行遗传转化并进行功能分析，为明确宁夏枸杞LbALDH3F1基因功能及其在响应盐胁迫过程中的应答机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

宁夏枸杞‘宁杞1号’种苗由宁夏农林科学院枸杞工程中心惠赠。将种苗种植于珍珠岩∶蛭石∶草木灰为1∶1∶1的培养基质中，人工培养室内培养1个月（8~12叶期），定期浇水，一周浇一次Hoagland营养液，培养条件为温度25±2 ℃、湿度42%、光周期16 h / 8 h、光照强度60 μmol/m²·s。选择长势一致、健康的幼苗，分别进行0、100、200、300 mmol/L NaCl胁迫处理，各处理组3次生物学重复，每个重复4盆幼苗，每盆20盒，每盒9株。处理第7天取相同部位叶片，液氮冷冻，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

真核表达试验材料哥伦比亚野生型拟南芥（Col-0）、植物双元表达载体pCAMBIA 2300-EGFP和农杆菌菌株GV 3101由本实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA的提取及LbALDH3F1基因克隆

采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取经NaCl胁迫处理的宁夏枸杞‘宁杞1号’叶片总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳及Nanodrop 2000微量核酸测定仪（赛默飞世尔科技公司）测定其浓度及质量。样品总RNA质量检测合格后构建cDNA测序文库。cDNA第一条链的合成参照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（Fermentas）说明书进行。

根据宁夏枸杞转录组序列结果^［

19］，利用Primer 5.0软件设计LbALDH3F1中间片段克隆引物LbALDH3F1-F与LbALDH3F1-R（表1），PCR扩增体系为25 μL 2×PCR Buffer，1 μL KOD FX Neo（1 U/μL），10 μL dNTP （2 mmol/L），2 μL LbALDH3F1-F （10 μmol/L），2 μL LbALDH3F1-R（10 μmol/L），5 μL模板cDNA，5 μL ddH₂O。扩增程序为98 ℃预变性5 min；98℃变性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸 90 s，35个循环；68℃终止延伸10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，OMEGA胶回收试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）回收目的片段，与pMD18-T载体进行连接及转化，阳性克隆进行测序分析，获得中间片段序列。

表 1 引物名称及序列

Table 1 The name and sequence of primers

引物名称 Primer name	引物序列（5′-3′） Primer sequence（5′-3′）	引物功能 Primer function
Actin-F	CCTAAGGCCAACAGAGAGAAA	Actin内参引物
Actin-R	CGACCACTAGCATACAAGGAA	Actin内参引物
3′GSP1	AAGCAGAACATCTTCAGGAAGTGTGGTATT	3′ RACE基因克隆引物
3′GSP2	TCCAATATGCAGCAGATACACTCCCATT	3′ RACE基因克隆引物
5′GSP1	CTCTGGTTTTCCCTGA	5′ RACE基因克隆引物
5′GSP2	AAAAGTCTCTCTAAGAAC
5′GSP3	TCCAAATCTTTCTCACACTCTG
LbALDH3F1-F	ATGTCAGAGTGTGAGAAAG	中间片段基因克隆引物
LbALDH3F1-R	TCAAGCCTTCTTGAGTCC	中间片段基因克隆引物
AD1	ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA	LbALDH3F1启动子克隆引物
AD2	ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT
AD3	ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAA
AD4	ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCGGT
LbALDH3F1-R1	AGACCAAGAGGCTCAGGAACAAAC
LbALDH3F1-R2	CTAATGTCCCAATCTCATCCCTGTAAGC
LbALDH3F1-R3	GTGACCTCCTCCATGATTCTTCTCTG
LbALDH3F1-F	GAGGCTTACAGGGATGAGATTG	枸杞qRT-PCR引物
LbALDH3F1-R	CCAAGAGGCTCAGGAACTAAC	枸杞qRT-PCR引物
LbALDH3F1-2300-EGFP-F	ACGGGGGACGAGCTCGGTACCATGTCAGAGTGTGAGAAAGATTTG	过表达载体目的基因扩增引物
LbALDH3F1-2300-EGFP-R	CACCATGGTGTCGACTCTAGAAGCCTTCTTGAGTCCTAGTG	过表达载体目的基因扩增引物
LbALDH3F1-T-F	GCAGCAGATACACTCCCATTTG	转基因拟南芥PCR鉴定引物
LbALDH3F1-T-R	GCCGTCGTCCTTGAAGAAGA	转基因拟南芥PCR鉴定引物
LbALDH3F1-F-Y	GAGGCTTACAGGGATGAGATTG	转基因拟南芥qRT-PCR引物
LbALDH3F1-R-Y	ACTCTGCTGAAGAAGGGAATG	转基因拟南芥qRT-PCR引物

加粗序列为与载体同源的序列

Sequences homologous to the vector are marked in bold

利用Primer 5.0设计3′ RACE引物3′GSP1和3′GSP2与5′ RACE引物5′ GSP1、5′ GSP2和5′ GSP3（表1），参照 3′- RACE试剂盒和5′- RACE 试剂盒（生工生物工程股份有限公司）操作手册，以反转录后的 cDNA 第一链为模版，进行宁夏枸杞LbALDH3F1基因的 3′ 末端扩增（3′ RACE）和5′末端扩增（5′RACE），将所获得的PCR产物进行凝胶电泳及目的条带回收，连接载体及转化，阳性克隆菌液测序，获得3′ 和5′端序列。最后将获得的宁夏枸杞LbALDH3F1基因中间片段、3′ 末端和5′ 末端片段进行拼接，得到完整的LbALDH3F1 基因序列。

1.2.2 LbALDH3F1基因序列分析

对克隆得到的宁夏枸杞LbALDH3F1 cDNA序列进行生物信息学分析。使用ProtParam（https：//web.expasy.org/compute_pi/）在线工具分析蛋白理化性质；使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）对蛋白的保守结构域进行分析；蛋白质的二级与三级结构则通过SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl？page=npsa_sopma.html）与SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）分别完成。

1.2.3 LbALDH3F1基因启动子克隆

启动子克隆参照史光珍等^［

20］方法，以宁夏枸杞叶片cDNA为模板，通过TAIL-PCR技术分3次扩增LbALDH3F1的上游序列，用Primer 5.0设计随机简并引物AD1~AD4和特异性引物LbALDH3F1-R1、LbALDH3F1-R2、LbALDH3F1-R3（表1），PCR扩增反应程序、体系参考Liu等^{［参考文献 21

百度学术}21］。PCR产物同中间片段克隆操作一致，最终获得启动子序列。利用DNAMAN软件比对测序结果，利用植物顺式元件数据库PLACE（www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）和数据库PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）预测及分析顺式调控作用元件。

1.2.4 LbALDH3F1基因遗传转化、鉴定及转基因拟南芥NaCl胁迫

利用Primer 5.0设计LbALDH3F1扩增引物LbALDH3F1-2300-EGFP-F和LbALDH3F1-2300-EGFP-R（表1），将LbALDH3F1 CDS 序列PCR扩增连接至2300EGFP表达载体，对应反应体系为20 μL 2×P515酶，1 μL LbALDH3F1-2300-EGFP-F （10 μmol/L），1 μL LbALDH3F1-2300-EGFP-R （10 μmol/L），0.5 μL cDNA模板，17.5 μL ddH₂O。扩增程序为95℃ 10 min；95℃ 30s，96℃ 30s，72℃ 60s，30个循环；72℃ 10 min。扩增产物进行凝胶电泳后将目的条带用Magen胶回收试剂盒（HiPure Gel Pure DNA Mini Kit）切胶回收。pCAMBIA 2300-EGFP真核表达载体通过Xba I和Kpn I进行双酶切，将PCR扩增产物和载体用NovoRec^® PCR一步定向克隆试剂盒（赛默飞世尔科技公司）进行连接，转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，用扩增引物进行PCR验证（PCR反应体系和程序同上）及测序，成功构建pCAMBIA 2300-EGFP-LbALDH3F1载体并转化农杆菌。将含有阳性重组质粒 pCAMBIA 2300-EGFP-LbALDH3F1 的农杆菌菌液配置成转化液，参照朱熙^［

22］方法转化拟南芥并采集保存T0代种子，将其培养并依次筛选得到T1~T3代。利用CTAB法提取野生型和转基因阳性拟南芥叶片 DNA并以此为模板进行PCR验证，利用Primer 5.0设计引物LbALDH3F1-T-F和 LbALDH3F1-T-R（表1），反应按照10 μL 2×Taq mix，正反向引物各0.4 μL ，2 μL gDNA，7.2 μL ddH₂O。扩增程序为94℃ 3min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s， 72 ℃ 60 s，35个循环；72℃ 5 min。

将转LbALDH3F1拟南芥T3代及野生型拟南芥种子表面消毒后，播种于MS固体培养基上生长7~10 d，之后移栽至育苗基质，人工气候培养箱中生长15~20 d，培养条件为22 ℃（光照16 h）/ 20 ℃（黑暗8 h），湿度60 %，光照强度700 μmol/m ²·s。选择长势一致、健康的T3代进行NaCl胁迫处理。试验设置0、100、200 、300 mmol/L NaCl浓度梯度。每组处理每天定期用对应浓度的NaCl溶液浇灌，直至溶液从排水孔析出，析出持续时间10 min，持续7 d，分别在处理后0 d、4 d、7d时观察并记录叶片的表型变化，并用SPSS Statistics 26.0软件进行存活数统计分析。NaCl处理后8 d进行叶片取样。野生型和转基因各4个处理组，各处理组重复3次，每个重复10株，每组30株。

1.2.5 ALDH3F1亚细胞定位

将测序鉴定正确的重组质粒加入感受态农杆菌GV 3101菌液中进行转化，28 ℃ 培养48 h左右。将培养出来的单菌落提取质粒并进行PCR鉴定，引物为LbALDH3F1-T-F、LbALDH3F1-T-R，扩增程序与体系参照1.2.4 PCR验证。检测为阳性的农杆菌用来侵染拟南芥叶片的原生质体。原生质体用1.5 mL预冷的W5 buffer轻柔悬浮，冰上放置30 min后离心1 min（23℃，100 g），弃上清，每管沉淀用800 μL MMG buffer重悬。每个2 mL离心管中加入20 μL阳性质粒和300 μL MMG buffer重悬的的原生质体，轻柔混匀，再加入250 μL PEG/Ca²⁺ buffer，轻柔混匀后放置30 min（23℃）。接着加入800 μL W5 buffer，轻柔混匀后，100 g离心3 min，弃上清，加入1 mL W5 buffer。轻柔混匀后，置于23 ℃，弱光孵育12~18 h。采用Olympus FV1000 viewer型共聚焦激光扫描显微镜（奥林巴斯）观察。

1.2.6 宁夏枸杞LbALDH3F1及转基因拟南芥LbALDH3F1响应NaCl胁迫的差异表达检测

宁夏枸杞和NaCl胁迫的野生型拟南芥、T3代转基因拟南芥叶片RNA、cDNA 第一链的合成按照1.2.1 方法执行。qRT-PCR定量实验使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒（诺唯赞生物科技有限公司）完成。用Premier 5.0分别设计宁夏枸杞的内参基因Actin的扩增引物Actin-F和Actin-R、qRT-PCR 扩增引物LbALDH3F1-F和LbALDH3F1-R、转LbALDH3F1拟南芥的扩增引物LbALDH3F1-F-Y和LbALDH3F1-R-Y（表1），用Roche LightCycler480型定量PCR仪（北京华恩时代科技发展有限公司）进行反应，qRT-PCR反应体系为10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master mix，0.5 μmol/L 正反向引物各0.5 μL，1.0 μL cDNA，8 μL ddH₂O，扩增条件为95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，共41个循环，每个反应3次技术重复。采用2^-ΔΔCt 法^［

23］对表达量进行分析。

1.2.7 NaCl胁迫下宁夏枸杞ALDH酶活及转基因拟南芥相关生理指标测定

采用苏州梦犀生物医药科技有限公司的乙醛脱氢酶（ALDH，aldehyde dehydrogenase）酶活检测试剂盒，对不同NaCl浓度处理的宁夏枸杞叶片ALDH的酶活进行测定。

采用睿信生物科技有限公司的过氧化氢酶（CAT，catalase）试剂盒、过氧化物酶（POD，peroxidase）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）-WST-8 法活性测定试剂盒分别测定野生型和转基因拟南芥CAT、POD和SOD活性。采用睿信生物科技有限公司的植物叶绿素（Chlorophyll）含量试剂盒、脯氨酸（Pro，proline）含量测定试剂盒、脱落酸（ABA，abscisic acid）定量检测试剂盒（ELISA）、丙二醛（MDA，malondialdehyde）含量检测试剂盒、过氧化氢（H₂O₂，hydrogen peroxide）含量检测试剂盒及羟自由基清除率检测试剂盒分别测定野生型和转基因拟南芥叶绿素、Pro、ABA、MDA、H₂O₂含量及羟自由基清除率。

2 结果与分析

2.1 LbALDH3F1基因克隆分析

经PCR扩增获得宁夏枸杞LbALDH3F1基因的中间片段（图1A），目的片段切胶回收连接T载体并转化后测序分析，获得长度为1446 bp的LbALDH3F1中间片段。使用巢式PCR和梯度PCR相结合克隆得到LbALDH3F1 5′和 3′端序列（图1B、C），对目的条带进行切胶回收，连接载体进行转化后测序分析，获得 3′ 和 5′端碱基序列，分别为401 bp和96 bp。将测序获得的基因中间片段序列和 3′与 5′端序列进行拼接，得到LbALDH3F1基因的全长序列为1700 bp，CDS序列为1446 bp（图2）。上传GenBank，登录号为OR365868。

图1 宁夏枸杞LbALDH3F1基因克隆

Fig. 1 Cloning of LbALDH3F1 gene from L. barbarum

A：LbALDH3F1基因中间片段；M：DL2000，下同；1：LbALDH3F1基因中间片段；B：LbALDH3F1基因3′克隆片段；2~3：3′RACE 产物；C： LbALDH3F1基因5′克隆片段；4~5：5′ RACE PCR产物

A： Amplification results of intermediate segments of LbALDH3F1； M： DL 2000；The same as below； 1： Intermediate segments of LbALDH3F1； B： Cloning of 3′fragments of LbALDH3F1 genes； 2-3： 3′RACE products；C： Cloning of 5′fragments of LbALDH3F1 genes；4-5： 5′RACE products

图2 LbALDH3F1的核苷酸序列（上）和推导氨基酸序列（下）

Fig. 2 Nucleotide sequence （upperlines） and deduced amino acid sequence （lowerlines） of LbALDH3F1 gene

红色ATG字体为起始密码子；红色TGA字体为终止密码子；粗体部分为CDS序列

The red ATG font is the iniation codon； The red TGA font is the termination codon， The bold part is CDS sequence

2.2 LbALDH3F1基因序列生物信息学分析

ProtParam软件在线预测分析结果表明，LbALDH3F1蛋白质的分子量为53.77177 kDa，理论等电点为9.01，脂肪指数为99.96，不稳定系数大于40，推测该蛋白为不稳定蛋白质，亲水性小于0，为亲水性蛋白，分子式为 C₂₄₆₁H₃₉₀₇N₆₂₅O₆₉₀S₁。

根据SOPMA在线网站对LbALDH3F1蛋白进行二级结构预测发现，二级结构主要由 α 螺旋和随机卷曲两种结构方式组成，分别有214和157个氨基酸，占44.49 % 和32.64 %，延伸链有79个氨基酸，占16.42 %，β转角有31个氨基酸，占6.44 %。在SWISS-MODEL网站选取相似度最近的6 k10.1.A为参照，构建LbALDH3F1三级结构模型，该同源模型覆盖了LbALDH3F1氨基酸序列的43.32 %（图3A），由图可看出LbALDH3F1蛋白空间结构大多为 α 螺旋和随机卷曲，与二级结构预测基本一致。

图3 LbALDH3F1基因序列三级结构预测、亚细胞定位及系统进化树分析

Fig. 3 Tertiary structure prediction， subcellular localization and phylogenetic tree analysis of the LbALDH3F1 gene sequence

A：LbALDH3F1蛋白的三级结构模型预测；B：LbALDH3F1亚细胞定位，比例尺均为10 μm；C：LbALDH3F1系统进化树，红框表示宁夏枸杞基因名称，条目格式为基因名称+物种+基因注释信息

A： Prediction of LbALDH3F1 protein tertiary structure model； B： Subcellular localization of LbALDH3F1， all scales are 10 μm； C： Phylogenetic tree of LbALDH3F1 gene； The red boxes indicate gene names； The format of term is gene name+species+gene annotation information of L. barbarum

通过共聚焦激光扫描显微镜观察发现，试验组在拟南芥的细胞核和部分细胞膜中检测到绿色荧光信号，表明LbALDH3F1定位于细胞核及部分细胞膜中（图3B）。

利用NCBI公布的ALDH3F1基因序列，构建基于LbALDH3F1同源基因的系统发育进化树。发现宁夏枸杞LbALDH3F1与渐狭叶烟草（Nicotiana attenuata Torr. ex S.Watson）的ALDH3F1基因序列相似性最高（图3C）。

2.3 LbALDH3F1启动子序列分析

2.3.1 启动子序列克隆

利用TAIL-PCR技术扩增得到基因的上游序列，测序结果经DNAMAN比对，发现LbALDH3F1启动子序列长度为1850 bp（图4），其 3′端与已知的基因全长的 5′端有85 bp相同，可知此片段为LbALDH3F1基因起始密码子ATG的上游序列。

图4 LbALDH3F1基因启动子片段

Fig. 4 LbALDH3F1 gene promoter fragment

1~2：LbALDH3F1启动子；红色字体为起始密码子，粗体部分为CDS序列

M： DL 2000； 1~2： The LbALDH3F1 promoter； The red font is start codon， the bold part is CDS sequence

2.3.2 启动子顺式作用元件预测

利用Plant CARE和PLACE在线工具对启动子序列进行顺式作用元件预测分析。LbALDH3F1启动子存在多个顺式作用元件响应 NaCl 胁迫，其中3-AF1 binding site、AE-box、G-box、GA-motif、GATA-motif、GT1-motif、LAMP-element、TCCC-motif元件参与光响应信号，ABRE、ABRE3a、ABRE4、MYB、MYC元件参与脱落酸信号，CGTCA-motif、TGACG-motif参与茉莉酸甲酯信号，TGA-element元件参与生长素信号（表2）。预测结果表明LbALDH3F1启动子可通过调控光反应和植物激素等途径来响应NaCl胁迫。此外，还发现LbALDH3F1的启动子区域含有3处TGA转录因子的结合位点as-1顺式作用元件，表明LbALDH3F1可能受到TGA转录因子的调控。

表2 LbALDH3F1基因启动子部分顺式作用元件

Table 2 Cis-acting elements of LbALDH3F1 gene promoter

顺式元件名称 Cis-acting elements name	特征序列 Characteristic sequence	功能 Function	位置（bp） Site
3-AF1 binding site	TAAGAGAGGAA	光反应响应元件	-486
ABRE	ACGTG	ABA、干旱、NaCl 响应元件	+69
ABRE3a	TACGTG	ABA响应元件	+68
ABRE4	CACGTA	ABA响应元件	-68
AE-box	AGAAACAA	光反应响应元件	-671
CGTCA-motif	CGTCA	MeJA响应元件	+718、-1146、-1066
G-box	TACGTG	光反应响应元件	+68、+1679
GA-motif	ATAGATAA	光反应响应元件	-232
GATA-motif	GATAGGA	光反应响应元件	-487
GT1-motif	GTGTGTGAA	光反应响应元件	-1027、+1398
LAMP-element	CCTTATCCA	光反应响应元件	-11
MYB	TAACCA	MYB结合位点；干旱响应元件；ABA响应元件	-90、-1438
MYC	CATTTG	MYC结合位点；干旱响应元件；ABA响应元件	-657、-1248
TCCC-motif	TCTCCCT	光反应响应元件	+25
TGA-element	AACGAC	生长素响应元件	-474
TGACG-motif	TGACG	MeJA响应元件	-718、+1146、+1066
as-1	TGACG	TGA转录因子的结合位点	-718、+1146、+1066

+表示上游，-表示下游

+ represents the upstream， and -represents the downstream

2.4 宁夏枸杞LbALDH3F1响应盐胁迫的差异表达分析及ALDH酶活变化

对不同浓度NaCl处理的枸杞叶片LbALDH3F1进行qRT-PCR分析。结果表明，随着NaCl胁迫程度增加， LbALDH3F1相对表达量呈先升高后下降的趋势，在200 mmol/L NaCl胁迫时表达量最高（图5A），说明LbALDH3F1参与了盐胁迫响应过程。

图5 宁夏枸杞不同浓度NaCl胁迫下LbALDH3F1相对表达量及ALDH酶活变化

Fig. 5 Relative expression of LbALDH3F1 and active changes of ALDH enzyme under different concentrations of NaCl stress in L. barbarum

不同小写字母表示差异显著（P < 0.05）；下同

The different lowercase letters indicate significant differences （P < 0.05）； The same as below

对不同NaCl浓度处理的宁夏枸杞叶片ALDH酶活进行测定，发现随着NaCl胁迫程度增加，ALDH酶活性呈先升高后下降的趋势，100 mmol/L NaCl处理显著高于其他处理（图5B）。

2.5 LbALDH3F1基因遗传转化及转基因植株耐盐性分析

2.5.1 转基因拟南芥DNA鉴定

转LbALDH3F1拟南芥目标片段大小在640 bp左右，测序序列与载体和部分目的基因片段序列相符，野生型拟南芥无条带，表明LbALDH3F1基因成功连接到2300-EGFP载体内，且成功转化到拟南芥基因组（图6）。

图6 转LbALDH3F1 拟南芥T1 代DNA电泳检测

Fig. 6 LbALDH3F1 transgenic A. thaliana T1 generation DNA electrophoresis detection

1~9：转LbALDH3F1拟南芥DNA；WT：阴性对照（野生型）；CK：空白对照（水）；P：阳性对照（农杆菌菌液）；下同

1-9： LbALDH3F1 transgenic A. thaliana DNA；WT： Negative control （wild type）； CK： Blank control （water）； P： Positive control （Agrobacterium tumefaciens）；The same as below

2.5.2 转基因拟南芥LbALDH3F1响应盐胁迫的差异表达分析

对盐胁迫下野生型及转基因拟南芥叶片进行qRT-PCR表达量分析，结果显示各浓度NaCl胁迫转基因拟南芥的表达量均显著高于野生型拟南芥，表明成功将宁夏枸杞LbALDH3F1基因转入拟南芥，而且转基因拟南芥LbALDH3F1基因在各浓度NaCl胁迫下差异表达显著（图7）。

图7 转基因拟南芥不同浓度NaCl胁迫下LbALDH3F1相对表达量

Fig. 7 Relative expression of LbALDH3F1 transgenic A. thaliana under different concentrations of NaCl stress

0、100、200、300表示不同浓度NaCl；下同

The 0，100，200， and 300 indicate different concentrations of NaCl； The same as below

2.5.3 盐胁迫下转基因拟南芥的表型分析

不同NaCl浓度处理野生型及转LbALDH3F1拟南芥的表型变化如图8 A所示，野生型拟南芥在300 mmol/L NaCl处理的4 d已出现叶缘失绿现象，而转LbALDH3F1拟南芥未发现该现象，表明盐胁迫对过表达LbALDH3F1拟南芥的伤害较野生型小。此外，对NaCl胁迫处理7 d 的拟南芥存活情况进行统计，发现经100、200 mmol/L NaCl处理的转基因与野生型拟南芥存活率均为100 %（图8B），而300 mmol/L NaCl胁迫的转基因拟南芥存活率为76.67 % ，野生型拟南芥是60.00 %，转基因拟南芥存活率较高于野生型拟南芥，表明过表达LbALDH3F1基因具有增强植株耐盐性的作用。

图8 不同浓度NaCl胁迫野生型和转LbALDH3F1拟南芥植株表型变化及存活情况

Fig. 8 Phenotypic change and survival data of different NaCl stressed wild type and LbALDH3F1 transgenic A. thaliana

A：不同NaCl浓度处理野生型和转LbALDH3F1拟南芥0/4/7 d的表型变化；WT-0/4/7：野生型拟南芥盐胁迫后0/4/7 d，LbALDH3F1-0/4/7：转基因拟南芥盐胁迫后0/4/7 d；B：不同NaCl浓度处理野生型和转LbALDH3F1拟南芥0/4/7 d的存活数；C：300 mmol/L NaCl胁迫野生型及转基因拟南芥存活率

A： Phenotypic changes in wild type and LbALDH3F1 transgenic A. thaliana treated with different NaCl concentrations on 0/4/7 d； WT-0/4/7： 0/4/7 d of salt stress in wild-type A. thaliana， LbALDH3F1-0/4/7： 0/4/7 d of salt stress in transgenic A. thaliana； B： Survival number of wild-type and LbALDH3F1 transgenic A. thaliana treated with different NaCl concentrations on 0/4/7 d； C： Survival rate of wild type and LbALDH3F1 transgenic A. thaliana under 300 mmol/L NaCl stress

2.5.4 盐胁迫下转基因拟南芥相关生理指标变化

对盐胁迫下野生型及过表达LbALDH3F1拟南芥相关抗氧化物质进行测定（图9），发现NaCl处理后，与野生型相比，过表达LbALDH3F1拟南芥的SOD活性显著升高，而盐浓度大于200 mmol/L 处理后，CAT和POD活性并无显著性差异。在高盐（300 mmol/LNaCl）胁迫下H₂O₂及MDA含量显著低于野生型，羟自由基清除率显著高于野生型拟南芥。

图9 转基因拟南芥相关生理指标

Fig. 9 Relevant physiological indicators of transgenic A. thaliana plants

对盐胁迫下野生型及过表达LbALDH3F1拟南芥的Pro、ABA及叶绿素a的含量进行测定，盐胁迫的转基因拟南芥Pro及叶绿素a的含量均较高于野生型，且在高盐（300 mmol/LNaCl）胁迫下均达到显著性差异，而盐胁迫下野生型及过表达LbALDH3F1拟南芥的ABA含量没有显著性差异。

3 讨论

宁夏枸杞作为重要的耐盐药用植物，耐盐基因功能分析对揭示其抗盐生理及分子机制至关重要。本研究通过RACE技术获得宁夏枸杞LbALDH3F1基因全长1700 bp，编码481个氨基酸残基，蛋白质二级结构以 α 螺旋和无规则卷曲为主，与渐狭叶烟草（N. attenuata）ALDH3F1同源性较高。

蛋白质的亚细胞定位与其功能密切相关^［

24］。有研究认为ALDH3定位于线粒体、胞质和细胞核^{［参考文献 25

百度学术}25］，也有认为ALDH3I1定位于叶绿体，而ALDH3H1定位于细胞质中^{［参考文献 26

百度学术}26］。本研究发现ALDH3F1主要定位于细胞核和部分细胞膜中，表明ALDH家族的不同蛋白存在定位差异，体现了蛋白功能的多样化，并表明不同的细胞区室可能存在特定功能的ALDH蛋白。此外，ALDH3的亲水性平均值为负值，有助于与 NAD（P）⁺和醛类的醛基结合，进而催化醛类物质起到解毒作用^{［参考文献 27

百度学术}27］。宁夏枸杞的ALDH3F1的亲水性平均值小于0，表明 ALDH3F1 蛋白为亲水性蛋白，有利于与 NAD（P）⁺和醛类的醛基结合，进而催化醛类物质起到解毒作用。

不同基因的启动子区含有不同功能的顺式作用元件，植物响应环境胁迫与这些顺式作用元件有关^［

28］。宁夏枸杞LbALDH3F1启动子区域含有多种胁迫相关的顺式作用元件，包括光反应响应元件，ABA响应元件、盐胁迫响应元件等。植物激素ABA介导多种生理过程，包括对盐胁迫的响应。LbALDH3F1启动子含有多个ABA响应元件，如ABRE与MYB/MYC等，这些顺式作用元件对应于盐胁迫响应启动子（RD29B、RD22等）发挥作用^{［参考文献 29

百度学术}29］，共同调节植物的胁迫响应。但本研究发现，盐胁迫下野生型及过表达LbALDH3F1拟南芥的ABA含量没有显著性差异，其响应机制还需要进一步研究。

ALDHs基因家族与植物的抗逆性和生长发育密切相关，如过表达Ath-ALDH3的拟南芥在遭遇干旱、NaCl 和 H₂O₂ 等胁迫时表现出更强的耐受性^［

30］，过表达花生Ah-ALDH3H1的大豆可以通过增加ALDH活性从而提高对盐碱胁迫的耐受性^{［参考文献 31

百度学术}31］，而过表达ALDH3F1可以提高转基因植株对菌核病和草铵膦的抗性^{［参考文献 32

百度学术}32］，且有研究认为ALDH3F1还可以调控开花时间^{［参考文献 33

百度学术}33］。本研究将宁夏枸杞LbALDH3F1过表达转化拟南芥并进行盐胁迫，发现经NaCl处理的转基因拟南芥所受盐胁迫的伤害较野生型小，有更高的存活率，且在高盐（300 mmol/LNaCl）胁迫下有更高的叶绿素a含量，这可能与LbALDH3F1启动子区域含有光反应响应元件和盐胁迫响应元件有关，有利于细胞进行光合作用积累能量进而增强抗盐性。此外，由于植物在逆境条件下通过一系列抗氧化防御系统减轻和修复由大量ROS产生所造成的伤害^{［参考文献 30

百度学术}30］，高水平的ALDH可激活抗氧化剂的生成，抑制活性氧物质在植株体内的累积，增强植物的抗氧化能力^{［参考文献 34-36}34-36］。本研究发现转基因拟南芥的SOD活性显著高于野生型，且在高盐（300 mmol/LNaCl）胁迫下H₂O₂及MDA含量显著低于野生型，Pro含量和羟自由基清除率显著高于野生型拟南芥。表明在盐胁迫条件下转LbALDH3F1拟南芥具有更强的活性氧清除能力，从而降低了体内活性氧的积累，减弱了 H₂O₂对抗氧化酶系统的损伤，增强了植物抗氧化能力，从而抵御盐胁迫带来的生理伤害。因此，在NaCl胁迫下宁夏枸杞可能通过诱导LbALDH3F1上调表达调控ALDH参与ROS清除进而减弱膜脂过氧化程度，维持细胞内ROS代谢平衡，增强植株的抗盐胁迫能力。

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