2025年5月22日 19:13 星期四
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基于表型性状和SSR标记的知母遗传多样性及关联分析  PDF

    狄根森 1
    ✉
    闫立萱 1
    任俊男 1
    吴立柱 2
    王泽永 1
    马春英 1
    ✉
1. 河北农业大学农学院,保定 071000; 2. 河北农业大学生命科学学院,保定 071000

最近更新:2025-01-23

DOI:10.13430/j.cnki.jpgr.20240527001

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EN 引
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目录contents
摘要
关键词
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.2 表型性状调查
1.3 SSR分子标记开发和利用
1.4 数据分析
2 结果与分析
2.1 表型性状的遗传多样性分析
2.2 基于SSR标记的遗传多样性分析
2.3 基于SSR标记聚类分析
2.4 知母种质资源主成分分析
2.5 表型性状与SSR标记关联分析
3 讨论
参考文献

摘要

为明确知母(Anemarrhena asphodeloides)种内种质的遗传背景,本研究利用聚类分析和主成分分析等方法,对160份知母种质材料进行了基于表型性状和SSR分子标记的遗传多样性分析。结果表明,21个表型性状的多样性指数变化范围为0.99~7.60,均值为1.99;变异系数的变化范围为17.22%~151.07%,均值为51.49%。采用新开发的27对SSR引物对160份知母种质材料进行毛细管电泳,共检测到143个等位基因,有效等位基因数变幅为0.56~7.40,均值为3.54;Shannon’s信息指数变幅为0.17~0.51,均值为0.36;多态信息含量变幅为0.15~0.50,均值为0.38。聚类分析表明,160份知母种质材料并没有明显的分开,但部分同一来源的知母成簇出现。主成分分析与聚类分析相互验证,也呈现相似的结果,这可能与不同地区的知母种植者频繁交换种子种苗有关。本研究通过卡方检验和T检验筛选出与6个表型性状相关联的9个SSR标记,可用于知母分子标记辅助育种。

关键词

知母; 表型性状; SSR标记; 遗传多样性; 关联分析

知母(Anemarrhena asphodeloides Bunge)为百合科知母属多年生草本植物,具有2000多年的药用历史[

参考文献 1
百度学术    
1],在世界范围内主要分布在中国、蒙古、韩国、日本等东亚国家[
参考文献 2
百度学术    
2]。知母最早记载于中国的《尔雅》,称其为“莐藩”[
参考文献 3
百度学术    
3],《广雅》称其为“芪母”,《本草纲目》中李时珍将其定义为“知母”[
参考文献 4
百度学术    
4]。知母的根状茎入药,性味苦、甘、寒,归肺、胃、肾经,具有清热泻火,滋阴润燥的功效,用于外感热病、高热烦渴、肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴、肠燥便秘等症[
参考文献 5
百度学术    
5]。研究证明其化学成分主要包括皂苷类、双苯吡酮类、生物碱类、氨基酸类、挥发油类等物质,现代药理研究表明,知母具有降血糖、解热、抗炎、利尿,抗癌,抗抑郁,改善老年性痴呆,改善骨质疏松等多种功效[
参考文献 6-7
6-7]。随着中医药卫生事业的发展,知母的市场需求量不断增加,引起人们掠夺式的过度采挖,导致知母野生资源日趋匮乏。为了解决知母野生资源供不应求的现状,人工栽培知母、仿野生栽培知母等已进入市场。我国栽培知母主产于河北、山西、陕西、甘肃、内蒙古、安徽等地,河北易县为知母道地产区[
参考文献 8
百度学术    
8]。由于知母药材栽培历史短,生产上尚无品种,而不同地区的知母种植者会通过不同渠道交换种子种苗,导致种质混杂,药材产量与质量参差不齐,与药材产量和质量密切相关的表型性状也表现出丰富的多样性,如何鉴定和利用这些表型性状对知母新品种选育及遗传改良具有重要的意义。

遗传多样性是生物多样性的基础,也是物种稳定和持续进化的动力。遗传多样性的研究方法包括形态学和分子标记技术等[

参考文献 9
百度学术    
9]。其中,形态学是最简单方便的标记方法,可以在一定程度上揭示植物遗传变异的程度。但形态特征容易受到生态条件的影响,仅使用形态标记进行遗传多样性研究具有一定的局限性[
参考文献 10
百度学术    
10]。DNA分子标记因不受生态因子的影响,近年来已经成为研究种质资源遗传多样性及分子辅助育种的重要手段,主要包括RFLP、RAPD、AFLP、SSR标记等。SSR标记也称微卫星序列标记,以其数量丰富、共显性遗传、多态性丰富等优点被广泛应用于药用植物的遗传多样性分析和亲缘关系鉴定等领域[
参考文献 11-13
11-13]。目前尚无SSR标记在知母上应用的报道,因此开发知母SSR标记,筛选与知母产量和质量相关的表型性状和SSR标记,是分子标记辅助育种的关键步骤,对于提高知母的产量及药用功效具有开创性的意义。

本研究采用磁珠法开发27对SSR分子标记,并利用统计分析、聚类分析、主成分分析及综合评价等方法对来自我国道地产区和非道地产区的160份知母种质进行表型性状和分子标记的遗传多样性分析,筛选与表型性状相关联的SSR分子标记,为知母种质资源鉴定以及分子标记辅助育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究材料为不同来源、多年生的知母种质资源160份(表1),其中河北省易县宝石村阳生仿野生知母95株、河北省易县宝石村阴生仿野生知母(板栗树下种植知母)42株、安徽省亳州市栽培知母1株、广东省韶关市栽培知母21株和河北农业大学教学实验基地栽培知母1株,均由河北农业大学农学院马春英副教授鉴定为百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bunge)。

表1  供试材料来源
Table 1  Source of test materials

序号

No.

来源

Source

缩写

Abbreviation

样本数

Sample size

样本编号

Sample number

1 河北省易县宝石村阳生仿野生知母 易县阳生 95 1~95
2 河北省易县宝石村阴生仿野生知母 易县阴生 42 X01~X42
3 广东省韶关市栽培知母 韶关栽培 21 G01~G21
4 安徽省亳州市栽培知母 亳州栽培 1 A01
5 河北省河北农业大学教学实验基地栽培知母 农大栽培 1 S01

1.2 表型性状调查

2022 年6月20-23日,在知母道地产区河北易县宝石村,于知母生长旺盛期选择阳生和阴生条件下两个知母群体,对表型性状有明显差异的单株进行地上部13个性状调查并挂牌标记。2022年10月份在药材收获期将标记知母挖出,调查6个地下部性状,同时将每个单株带芦头部分种植于易县宝石村。韶关市栽培知母、亳州市栽培知母、河北农业大学教学实验基地栽培知母为邮寄的成熟期样品,只调查了地下部表型性状和部分地上部分蘖数、主分蘖叶数、叶长、叶宽4个表型性状,未调查生长旺盛期花色,主花薹长,主花薹粗等地上部表型性状。由于带芦头的一部分根茎需继续种植用于后续性状观察,无法准确测量单株根茎产量数据,因此本研究使用单株根茎体积代表单株根茎产量,同时为了便于分析,将成熟期知母根茎中的芒果苷含量和新芒果苷含量两个指标列入表型性状。综上,本研究共测定21个表型性状,包括19个数量性状和2个质量性状,2个质量性状分别为株型和花色。各性状测量方法见表2。知母部分表型性状见图1。

表2  表型性状测定标准
Table 2  Criteria for the determination of phenotypic traits

性状

Traits

测定方法

Assay method

单位

Unit

分蘖数 Tiller number 单株分蘖的个数 个

单株外围周长

Perimeter of individual plant

单株所有分蘖围成的外围长度 cm

主分蘖叶数

Leaf number of main tiller

每个单株主分蘖上叶片的个数 片
叶长 Leaf length 主分蘖短缩茎中部第4、5、6片叶片基部至叶尖长度的平均值 cm
叶宽 Leaf width 主分蘖短缩茎中部第4、5、6片叶片最宽处的平均值 cm

主花薹长

Length of main flower stalk

主分蘖花薹基部到顶端的长度 cm

主花薹粗

Width of main flower stalk

主分蘖花薹基部的直径 mm
结果数 Fruit number 单株蒴果数总和 个
株高 Plant height 自然状态下植株基部至叶片顶端的高度 cm
株幅 Stem width 单株基部向上10 cm处的外围长度 cm
叶厚 Leaf thickness 主分蘖上叶片的平均厚度 mm
株型 Plant type 松散型为1级,半紧凑型为2级,紧凑型为3级;根据第 4、5、6 片叶片与主茎的夹角平均值判定:1级>40°,40°>2级>20°,20°>3 级
花色 Flower color 白色为1级,白紫色为2级,浅紫色为3级,紫色为4级,深紫色为5级

地下器官鲜重

Fresh weight of underground organ

单株根茎和须根的重量 kg
根茎长 Rhizome length 单株根茎的长度之和 cm

根茎直径(长)

Rhizome diameter (length)

单株根茎最宽处的横轴直径 mm

根茎直径(宽)

Rhizome diameter (width)

单株根茎最宽处的短轴直径 mm
须根密度 Fibrous root density 平均每厘米根茎上的须根数量 个/cm
根茎体积 Rhizome volume 根茎长度×根茎直径(长)×根茎直径(宽) mm3
芒果苷含量 Mangiferin content 色谱条件、标准品溶液和供试品溶液的制备参考钟可[
参考文献 14
百度学术    
14]
g/g
新芒果苷含量 Nemangiferin content 色谱条件、标准品溶液和供试品溶液的制备参考钟可[
参考文献 14
百度学术    
14]
g/g

图1  知母部分表型性状

Fig. 1  Partial phenotypic characters of A. asphodeloides

A:白花;B:白紫花;C:浅紫花;D:紫花;E:深紫花;F:红线连接为单株外围周长;G:红线连接为根茎长;H:红色线段表示根茎直径(长),蓝色线段表示根茎直径宽;I:紧凑型;J:半紧凑型;K:松散型

A: White flower; B: White purple flower; C:Light purple flower; D: Purple flower; E: Deep purple flower; F:The red line connection is perimeter of individual plant; G: The red line is rhizome length; H: The red line is rhizome diameter (length), and the blue line is rhizome diameter (width); I: Compact; J: Semi-compact; K: Loose type

1.3 SSR分子标记开发和利用

在知母收获期,挑选每个知母种质的 2 片幼嫩叶片,用剪刀从基部剪下 2 cm 后置于 PE 管中,储藏至超低温冰箱。从160份知母种质中选择24份在株高、叶长、叶宽等地上部性状和根茎长、根茎直径(长)、根茎体积等地下部性状上差异大的知母材料,用其超低温储藏的幼嫩叶片混合建池,由上海派森诺基因科技有限公司完成高通量测序,然后设计SSR引物;根据引物多态性筛选100对引物,使用24个建池单株样本对引物进行多态性的检测和验证,最终筛选出27对群体验证引物(表3),利用这些引物采用毛细管检测方法[

参考文献 15
百度学术    
15]对160份知母种质进行遗传多样性分析。PCR反应体系为2× M5 Hipe Tap Hif PCR mix(北京聚合美生物科技有限公司) 10 μL,DNA 1 μL, 上游引物1 μL,下游引物1 μL, dd H2O 7 μL。PCR扩增程序:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35次循环;72 ℃再延伸10 min。

表3  SSR标记信息列表
Table 3  List of SSR marker information

标记名称

Marker name

上游引物序列(5'-3')

Forward primer sequence(5'-3')

下游引物序列(5'-3')

Reverse primer sequence(5'-3')

P2 CATTCAATCAAGTGGCATCG GACCGAAATCAAACCAGCAC
P4 TCTTTGGCTCCTCTCTCTCG TCCGATTGGATTTTGATTTC
P13 CCACCCTGTTGCTCTCTCTC AACAAAGGATGAAGGCTTGC
P14 TGGTTGAGGGAGAGTCAAGC TGCAGGGATCTAGATTTGGG
P15 CGAACATGATGACAAGGACG GAGAGCTCCACAGGATACACAG
P25 CCTCGGACGTGAGAGAGAAG TTTTGGGAGAGCCATAATGC
P26 TGGAAATCAGATGTTATGGGC GCTGTGATGTTGGTTTGTGG
P36 GGATGTATTCCTCACACCCG TCTTTGCCCCTACATCCTTG
P37 AAGAAGATGATGACCTGCCG GGAAGAAGCTGGATGAGCAG
P40 TCCTTTCACCCACCTCTCTC TGAGCAACAGAGGTAATGCG
P42 CTCCGTTGGTGAGAAGAAGG TGGAATGCTCTGCAAACAAG
P43 GGAGAGAGAATTTGTGAGGGG GGGTTGTAAACCGGTGACTG
P49 GTAACCATGCCACATCCTCC AGGAAGACAGAGGGAGAGCC
P50 GCAGACCCGTTATCGAAGAG GCGCTTGACTTCGTAGAACC
P53 TTTAAGATCCACGCCAAAGG CGAGAGAGAGAACGAGAGGG
P56 TAATGGGTGGTTGGAGAAGC TTTGAAATGCTGTGTTTGGC
P58 AGCCGGACTTACACCATCAG AAAAGCAATGTCGATCTCCG
P61 CGATGGAGGAGGGGTTTAAG AAAATTTGCTAACATGGCGG
P62 CGATAGCTCTTGGGAGCAAC TGACGTCGCTTGAGAGTTTG
P65 ACGATTGAACGAACGTTTCC GCGTAGAGAGGCGAAAATTG
P67 ATTCGCAACCGCAATTTAAC TTTCTTCGTTACGGTGGAGG
P69 TATTTGTCAGGCTGCTGCAC TTGACAAACACACAACACCG
P72 TTCGGCGAAGCATACCTG ATGTCAGCGATCCAGAAACC
P76 CCAAAACCTGTAGCAGGAGC GGCTGGTCACATGTCATTCT
P77 CATATATGTGTGTGTGTATGTGTGTG TGACAATTTCACATTGAGTGGA
P82 TTGGACCTATTCTGTAAGGCG AGGCTATGCATCCCCAAGTT
P98 TGACGGTGGGCTTAAGTAGC GCAATTTTGACATTATGTGTGTG

1.4 数据分析

1.4.1 表型性状统计与分析

采用 SPSS 26.0 软件对表型性状数据进行统计分析,包括平均值、最大值、最小值、标准差和单因素方差检验。在Excel中计算变异系数、多态信息含量、遗传多样性指数。使用Origin对表型性状进行主成分分析。

变异系数公式:CV=(标准差/平均值)×100%

多态信息含量(PIC,polymorphism information content)的公式为:PICi = 1 -∑Pij2

式中:PIC为多态信息含量,Pij表示位点i的第j个等位变异出现的频率,i表示第i个等位基因。

根据性状平均值(Xi)和标准差(σ)将各个性状的观测值划分为10 级,每0.5σ 为1 级,从第1 级(Xi<x-2σ)到第10 级(Xi ≥x+2σ),x为某个性状的平均数,每一组的相对频率用于计算多样性指数。

各个等级的分布频率(Pi)的计算公式为:Pi=ni/N

式中:ni表示某个性状处于第i 级的材料个数,N 表示材料总数。

Shannon′s 多样性指数(I,shannon's diversity index)公式:I=-∑PilnPi

式中:i为某一性状的分级,Pi为该性状第i级内材料份数占总份数的百分比。

1.4.2 SSR标记性状统计与分析

根据27对分子标记检测160份材料的结果,采用人工读带,将电泳图上能清晰分辨的条带记为“1”,同一位置无带记为“0”,建立原始矩阵。利用PopGene32 软件计算观测等位基因数(Na,number of average allele)、有效等位基因数(Ne,effective number of alleles)、Nei's 多样性指数(Nei's diversity index)及Shannon's信息指数(I),并计算多态信息含量。采用R编程语言中的绘图功能绘制聚类分析图。

2 结果与分析

2.1 表型性状的遗传多样性分析

由于亳州栽培和农大栽培的知母材料均只有1株,无法进行遗传多样性分析。因此对158份知母种质的21个表型性状进行测量分析,并计算变异系数和遗传多样性指数(表4)。21个表型性状的变异系数范围在17.22%~151.07%,其中最大的为结果数,最小的为根茎直径(长),变异系数均值为51.49%;多样性指数范围为0.99~7.60,其中最大的为结果数,最小的为叶厚,均值为1.99,说明本研究158份知母种质的21个表型性状在知母群体中存在较高的遗传多样性。

表4  表型性状多样性分析
Table 4  Diversity analysis of phenotypic traits

性状

Traits

变异系数(%)

CV

多样性指数

Diversity

index

来源

Source

平均值

Average value

变幅

Amplitude of variation

标准差

SD

新芒果苷含量(g/g)

Nemangiferin content

43.83 2.00 易县阳生 0.014 0.001~0.035 0.007
韶关栽培 0.008 0.003~0.012 0.003
易县阴生 0.012 0.003~0.033 0.006
均值 0.011 0.002~0.026 0.005

芒果苷含量(g/g)

Mangiferin content

42.28 2.02 易县阳生 0.010 0.003~0.022 0.004
韶关栽培 0.010 0.005~0.020 0.004
易县阴生 0.011 0.004~0.024 0.005
均值 0.010 0.004~ 0.022 0.004

分蘖数

Tiller number

59.38 1.82 易县阳生 7.970 1~38 6.057
韶关栽培 14.950 7~25 4.347
易县阴生 3.240 1~14 2.367
均值 8.720 3~25.667 4.257

单株外围周长(cm)

Perimeter of individual plant

72.86 1.93 易县阳生 67.980 14~170 40.736
韶关栽培 - - -
易县阴生 37.190 0~167 31.909
均值 52.585 7.000~168.500 36.323

主分蘖叶数

Leaf number of main tiller

56.87 1.63 易县阳生 24.880 12~112 11.361
韶关栽培 26.050 10~119 22.589
易县阴生 23.900 0~47 9.141
均值 24.943 7.330~92.670 14.364

叶长(cm)

Leaf length

27.02 1.97 易县阳生 30.712 15.670~46.670 6.786
韶关栽培 52.733 25.000~75.330 12.511
易县阴生 37.048 0~60 13.055
均值 40.164 13.560~60.670 10.784

叶宽(cm)

Leaf width

30.45 2.01 易县阳生 1.161 0.500~1.970 0.298
韶关栽培 0.968 0.500~1.700 0.312
易县阴生 1.041 0~2.300 0.348
均值 1.057 0.330~1.990 0.319

主花薹长(cm)

Length of main flower stalk

26.85 1.72 易县阳生 113.174 34~189 28.641
韶关栽培 - - -
易县阴生 98.238 0~145 27.884
均值 105.706 17~167 28.263

主花薹粗(mm)

Width of main flower stalk

33.29 1.58 易县阳生 3.904 2.810~6.320 1.370
韶关栽培 - - -
易县阴生 3.673 2.330~6.120 1.156
均值 3.789 1.170~6.220 1.263

结果数

Fruit number

151.07 7.60 易县阳生 5.880 0~39 7.926
韶关栽培 - - -
易县阴生 4.830 0~31 8.082
均值 5.355 0~35 8.004

株高(cm)

Plant height

31.70 1.51 易县阳生 45.700 31~70 16.434
韶关栽培 - - -
易县阴生 45.476 33~68 12.475
均值 45.588 16.5~69.0 14.455

株幅(cm)

Stem width

32.54 1.77 易县阳生 76.190 29~176 24.590
韶关栽培 - - -
易县阴生 75.760 38~152 24.860
均值 75.975 33.5~164.0 24.725

叶厚(mm)

Leaf thickness

75.48 0.99 易县阳生 0.406 0.29~0.61 0.139
韶关栽培 - - -
易县阴生 0.479 2.290~3.950 0.559
均值 0.443 0.140~2.280 0.349

株型

Plant type

46.71 1.35 易县阳生 1.650 0~3 0.860
韶关栽培 - - -
易县阴生 2.000 0~3 0.826
均值 1.825 0~3 0.843

花色

Flower color

37.65 1.57 易县阳生 2.940 0~5 1.165
韶关栽培 - - -
易县阴生 2.930 0~5 1.045
均值 2.935 0~5 1.105

地下器官鲜重(kg)

Fresh weight of underground organs

68.03 1.90 易县阳生 0.212 0.018~0.936 0.156
韶关栽培 0.255 0.110~0.420 0.072
易县阴生 0.067 0.020~0.440 0.069
均值 0.178 0.048~0.598 0.099

根茎长(cm)

Rhizome length

61.28 1.82 易县阳生 79.689 12.000~408.500 58.719
韶关栽培 167.250 43.500~295.000 55.532
易县阴生 28.452 10.000~103.000 21.897
均值 91.797 21.830~268.830 45.383

根茎直径(长)(mm)

Rhizome diameter (length)

17.22 2.03 易县阳生 16.424 11.010~23.360 2.429
韶关栽培 19.339 14.790~25.910 2.924
易县阴生 14.320 8.850~25.200 3.117
均值 16.694 11.550~24.820 2.823

根茎直径(宽)(mm)

Rhizome diameter (width)

40.25 1.06 易县阳生 13.606 8.330~115.250 10.825
韶关栽培 16.171 12.270~22.210 2.583
易县阴生 11.696 7.910~24.230 2.950
均值 13.824 9.500~53.890 5.453

根茎体积(mm3)

Rhizome volume

97.44 1.63 易县阳生 17088.789 1919.450~94720.430 13540.400
韶关栽培 53996.174 11916.360~120727.100 25541.930
易县阴生 5856.883 1014.300~62891.390 9710.055
均值 25647.282 4950.040~92779.740 16264.130

须根密度(个/cm)

Fibrous root density

29.07 1.81 易县阳生 3.858 1.910~11.140 1.627
韶关栽培 2.941 1.800~3.880 0.569
易县阴生 2.930 0.730~4.800 0.752
均值 3.243 1.480~6.600 0.983

-:无数据

-:No data

2.2 基于SSR标记的遗传多样性分析

从100对SSR标记中最终筛选出扩增条带清晰、重复性高的SSR标记27对,27对标记在160份知母中共检测出143个等位变异,每个标记的多态性条带数变幅为1~12个,平均为5.3个。其中,多态性位点最丰富的是P4标记,P53、P56、P58、P37、P76和P67标记检测到的等位基因较少,分别为4个、4个、4个、3个、3个和2个。有效等位基因数变幅为0.56~7.40,平均为3.54;Shannon's信息指数变幅为0.17~0.51,平均为0.36;多态信息含量变幅为0.15~0.50,平均为0.38 (表5)。图2为P53标记在知母供试材料中的扩增图谱。

表5  27对SSR标记遗传多样性参数
Table 5  Genetic diversity parameters of 27 SSR markers

标记

Marker

多态性条带数

Polymorphic band number

有效等位基因数

Ne

Nei's 多样性指数

Nei's diversity index

Shannon’s信息指数

I

多态信息含量

PIC

P13 5 3.42 0.24 0.39 0.43
P14 7 4.38 0.16 0.26 0.32
P15 5 3.20 0.19 0.31 0.40
P2 8 4.80 0.15 0.25 0.27
P25 6 4.11 0.24 0.39 0.41
P26 5 3.44 0.24 0.39 0.41
P36 6 4.14 0.26 0.42 0.41
P37 3 2.21 0.29 0.45 0.50
P4 12 7.40 0.18 0.31 0.31
P40 6 3.98 0.22 0.35 0.37
P42 5 3.47 0.26 0.41 0.41
P43 5 2.95 0.11 0.19 0.33
P49 5 3.61 0.28 0.44 0.44
P50 7 4.65 0.24 0.39 0.38
P53 4 2.88 0.26 0.41 0.44
P56 4 3.08 0.33 0.50 0.48
P58 4 2.91 0.28 0.44 0.45
P61 7 4.37 0.16 0.27 0.32
P62 6 3.83 0.20 0.33 0.34
P65 5 3.70 0.31 0.48 0.46
P67 2 1.09 0.08 0.17 0.15
P69 5 3.48 0.24 0.38 0.42
P72 7 4.36 0.18 0.31 0.32
P76 3 2.47 0.35 0.51 0.50
P77 5 3.51 0.24 0.38 0.41
P82 5 3.48 0.25 0.39 0.41
P98 1 0.56 0.11 0.22 0.20
均值Mean 5.30 3.54 0.22 0.36 0.38

Ne:Effective number of alleles;I:Shannon′s diversity index;PIC:Polymorphism information conten

图2  P53标记扩增产物的毛细管电泳检测

Fig. 2  Capillary electrophoresis assay of the product amplified by marker P53

A为15号知母种质,扩增产物大小为133 bp;B为41号知母种质,扩增产物大小为141 bp;C为13号知母种质,扩增产物大小为148 bp;D为43号知母种质,扩增产物大小为157 bp;横坐标为扩增片段长度,纵坐标为荧光信号强度;al为片段长度;sz为保留时间;ht为峰面积

A is germplasm No.15,the amplified product size was 133 bp; B is germplasm No.41,the amplified product size was 141 bp; C is germplasm No.13,the amplified product size was 148 bp; D is germplasm No.43,the amplified product size was 157 bp;The horizontal coordinate is the amplified fragment length, the ordinate is the fluorescence signal intensity; al is the fragment length; sz indicates the retention time; ht is the peak area

2.3 基于SSR标记聚类分析

利用R 语言中的绘图功能对160份材料进行聚类分析,结果表明160份材料被划分为3大类群(图3)。类群1中共有26份材料,其中韶关栽培知母8份,易县阳生仿野生知母11份,易县阴生仿野生知母6份,安徽亳州栽培知母1份;类群2共有38份材料,其中韶关栽培知母3份,易县阳生仿野生知母25份,易县阴生仿野生知母10份;类3群共有96份材料,其中韶关栽培知母10份,易县阳生仿野生知母59份,易县阴生仿野生知母26份,河北农业大学教学实验基地栽培知母1份。从聚类图可以发现,5个不同来源地和两种栽培条件下的知母种质资源并没有很明显的分开,聚类结果与知母种质的来源地并没有明显的相关性,说明不同来源地的知母种质没有明显的分化。但部分同一来源的知母资源成簇出现,如X34、X40均为易县宝石村阴生仿野生知母,G04、G21均为韶关栽培知母。

图3  160份知母种质聚类分析

Fig. 3  Cluster analysis of 160 germplasms

材料编号同表1,下同

Material numbers are the same as those in table 1,the same as below

2.4 知母种质资源主成分分析

为了更好地验证知母种质间的遗传关系,利用Origin对供试材料进行主成分分析,以第1 主成分和第2 主成分分别作为横坐标和纵坐标,构建二维主成分分析图(图4)。其中第1 主成分解释率为3.4%,第2 主成分解释率为3.2%。主成分分析将160份种质划分为3 个组,每一组均分布在不同象限内。

图4  160份知母种质主成分分析的二维散点图

Fig. 4  Two dimensional scatter plot for principal component analysis of 160 spermatogony germplasms

主成分分析表明,4个象限中均有韶关栽培知母、易县阳生仿野生知母和易县阴生仿野生知母,并且聚类分析中组1的亳州栽培知母和组3中河北农业大学教学实验基地栽培知母分别分布在第三和第二象限。主成分分析从不同角度直观反映出供试材料间的亲缘关系,不同颜色的圆点代表不同地区的知母种质材料,由图4可知,5个地区的种质并没有明显分开,只有少量几个种质材料聚在距离原点较远的区域,比如X34和X40,G04和G21,X25和X21。同样是易县阴生仿野生知母,X05却与X34、X40分布在相距较远的象限中。聚类分析中部分成簇出现的X34、X40和 G04、G21在主成分分析中分布也较近,两者呈现相似的结果,因此主成分分析与聚类分析可以相互验证。

2.5 表型性状与SSR标记关联分析

27对SSR标记在质量性状上进行卡方检验,数量性状上进行T检验,结果显示(表6),有9个SSR标记与6个表型性状显著或极显著相关。其中,P25标记与根茎体积和地下器官鲜重均达到极显著相关;P15标记与根茎直径(长)和芒果苷含量均达到极显著相关,与根茎体积达到显著相关;P4标记与芒果苷含量达到极显著相关;P42和P67均与叶长达到极显著相关,P62、P69和P61均与叶长达显著相关;P36与分蘖数达到显著相关。

表6  与表型性状显著关联的SSR标记
Table 6  Quantitative traits were significantly correlated with SSR markers

性状

Traits

标记

Marker

F值

F value

根茎体积 Rhizome volume P15 2.49*
P25 0.79**
地下器官鲜重 Fresh weight of underground organs P25 0.39**
根茎直径(长) Rhizome diameter (length) P15 0.06**
芒果苷含量 Mangiferin content P4 4.46**
P15 6.29**
叶长 Leaf length P42 6.68**
P62 10.01*
P67 5.71**
P69 4.92*
P61 0.78*
分蘖数 Tiller number P36 0.33*

*、**分别表示在P<0.05、P<0.01水平上显著相关

* and ** indicated significant correlation at P<0.05 and P<0.01 levels, respectively

3 讨论

分子标记和形态学性状可在植物分类、品种鉴别和遗传多样性分析中起到互补作用,本研究将两者结合应用于道地产区知母和非道地产区知母的遗传多样性分析,并筛选与表型性状相关联的SSR分子标记,对利用这些表型性状进行知母新品种选育及遗传改良具有重要的意义。

本研究对158份知母种质进行了表型性状的遗传多样性分析,发现不同来源地的知母种质间表型性状差异较大,甚至同一道地产区,阳生和阴生条件下种质间表型性状差异也较大,说明本研究调查的表型性状在知母的种群间和种群内均存在较高的遗传多样性。

李文秀等[

参考文献 11
百度学术    
11]利用71对SSR引物对84份砂仁资源进行了遗传多样性分析,表明了砂仁群体内具有丰富的遗传多样性;许祎珂等[
参考文献 16
百度学术    
16]利用100对引物对27份半夏资源进行了遗传多样性分析,筛选出10对具有高度多态性的引物,结果表明在半夏群体内表现出较高的遗传多样性水平。SSR分子标记对于不同药用植物的遗传多样性分析具有一定的意义。本研究通过开发知母的SSR分子标记,检测到160份知母材料中有143个等位变异,每个标记的等位基因数平均为5.3个,有效等位基因数平均为3.54;Shannon′s信息指数平均为0.36,多态信息含量平均为0.38,说明本研究筛选的SSR引物多态性较高,鉴别能力强,能够精准评价160份知母种质的遗传多样性。

本研究聚类分析表明,160份材料被划分为3大类群,并没有将不同地区的知母资源完全分开,知母目前栽培的地区有河北、山西、陕西、甘肃、内蒙古、安徽等地,调研发现,不同地区的知母种植者通过不同途径频繁交换种子种苗。Oh等[

参考文献 17
百度学术    
17]研究200份不同地理位置来源的紫苏种质,结果表明这些种质并没有按地理位置进行聚类,这与不同地区的紫苏种植者在很长一段时间内通过各种途径频繁交换种子有关,与本研究的聚类结果一致。主成分分析结果与聚类分析的结果相似,5个不同来源的知母种质并没有明显分开,说明聚类分析和主成分分析可以相互验证。许祎珂等[
参考文献 16
百度学术    
16]对27份半夏进行了主成分分析和聚类分析,同样呈现了相似的结果,说明在进行药用植物遗传多样性分析中主成分分析结合聚类分析法可更清晰地表明各材料之间的关系。

表型性状与SSR标记关联分析是一种研究遗传多样性和基因型与表型之间关联关系的方法。张嘉[

参考文献 18
百度学术    
18]在基于SSR标记的中国芍药品种分子身份证构建及观赏性状关联分析中发现,芍药共有23个SSR位点与8个性状相关联。于彤[
参考文献 19
百度学术    
19]在基于ISSR分子标记的土沉香遗传多样性评价及重要性状关联分析中发现,土沉香19个ISSR分子标记与16个性状间具有一定关联,其中4个标记与多个性状相关联;株高、含水量和叶柄长同时与2个标记相关联,叶干重、叶长、叶周长和叶厚同时与1个标记相关联。本研究发现知母中9个SSR标记与6个性状相关联,且部分SSR标记位点与多个性状相关联。本研究发现这种位点共有两个,分别为P15和P25。P15与根茎体积、根茎直径(长)和芒果苷含量密切关联;P25与根茎体积和地下器官鲜重密切关联。同时本研究发现根茎体积同时与P15和P25相关联,芒果苷含量同时与P4和P15相关联,叶长同时与P42、P62、P67、P69和P61相关联。本研究为知母的育种提供理论依据,挖掘出的标记位点需要进一步展开相关的研究。

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