水稻核心种质耐盐鉴定与分子标记开发应用

王世壮; 聂亚敏; 黄婧芬; 张巧玲; 郑崇珂; 谢先芝; 王艳艳; 邢梦; 陈文熹; 陈子易; 郑晓明; 王文生; 杨庆文; 乔卫华; WANG Shizhuang; NIE Yamin; HUANG Jingfen; ZHANG Qiaoling; ZHENG Chongke; XIE Xianzhi; WANG Yanyan; XING Meng; CHEN Wenxi; CHEN Ziyi; ZHENG Xiaoming; WANG Wensheng; YANG Qingwen; QIAO Weihua

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1. 中国农业科学院作物科学研究所/作物基因资源与育种全国重点实验室，北京 100081； 2. 三亚中国农业科学院国家南繁研究院，海南三亚 572024； 3. 济宁市农业科学院，山东济宁 272007； 4. 山东省水稻研究所，济南 250100

最近更新：2025-03-07

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240602001

摘要

水稻是盐敏感植物，土壤盐渍化对水稻产量影响巨大。发掘并聚合耐盐基因的优异单倍型，创制耐盐种质，对于水稻耐盐品种选育及我国盐碱地的高效利用都具有重要意义。本研究首先对水稻3K数据库的236份核心种质进行苗期及大田耐盐鉴定，筛选出一份来自澳大利亚的强耐盐种质‘71011’，其在150 mmol/L NaCl处理条件下存活天数25.5 d，耐盐等级5.2，大田盐胁迫浓度为0.3%~0.5%条件下耐盐存活率100%；利用236份核心种质对已报道的、功能清晰的20个耐盐基因进行单倍型分析，筛选出AKT1、CPK12、MYB48、P5CS1、SIK1、SKC1、SNAC1、HKT1共8个与耐盐性状相关联的基因单倍型。然后利用耐盐品种‘盐丰47’与普通品种‘农垦57’作为亲本，分析序列差异、验证表达量并构建重组自交系，最终开发出AKT1、MYB48以及HKT1三个耐盐相关基因的分子标记，并利用分子标记聚合耐盐基因优异单倍型，创制出强耐盐的新品系。研究结果为水稻耐盐育种提供了可利用的分子标记、耐盐品种资源与创新种质。

关键词

水稻种质资源; 耐盐鉴定; 单倍型分析; 分子标记

盐碱地是国家后备的农业耕地资源，具有重要的战略意义。现如今盐渍化影响了全球超过三分之一的灌溉土地^［

1］，我国有近1亿hm²盐碱地，并且面积还在逐渐扩大^{［参考文献 2

百度学术}2］。栽培稻是中度盐敏感的作物，盐胁迫是水稻生产中主要的非生物胁迫之一^{［参考文献 3

百度学术}3］。水稻在种子萌发期以及苗期对盐胁迫极为敏感，在生殖生长阶段受到盐胁迫则严重影响产量，并造成稻米品质的下降^{［参考文献 4

百度学术}4］。我国目前约有五分之一的水稻田已经受到盐渍化的危害^{［参考文献 5

百度学术}5］。近年来，耐盐碱水稻已成为盐碱地与滩涂地改良与利用的首选粮食作物，种植耐盐水稻在国内外多地得到了实践^{［参考文献 6

百度学术}6］。发掘优异抗性基因，创制综合农艺性状优良且具有强盐碱耐性的水稻新种质是利用盐碱地生产粮食的有效途径。

国内外育种家进行了大量耐盐碱水稻品种的选育和收集，斯里兰卡在1939年最早培育出一份耐盐水稻品种Pokkali，随后，印度、菲律宾、日本等也相继培育出耐盐水稻品种，如Nona Bokra、Kalarata 1-24、SR 26B、Chin.13、349 Jhona等^［

7-9］。我国于20世纪50年代开展水稻耐盐性鉴定研究工作，20世纪70年代江苏省农业科学院等多家单位对国内水稻种质进行耐盐鉴定，先后筛选出长毛谷、韭菜青等耐盐性较强的地方水稻品种^{［参考文献 10

百度学术}10］。随着对耐盐水稻品种的重视，我国陆续培育出盐粳927、辽盐2号、盐丰47、盐稻21号等耐盐水稻品种^{［参考文献 11

百度学术}11］。此外，国内外学者已经鉴定了很多与水稻耐盐相关的基因，同时也发现一些与功能相关的变异位点^{［参考文献 12

百度学术}12］。但是大部分基因是利用反向遗传学或者突变体进行功能研究，在水稻育种与生产中难以利用。鉴定出的具有自然变异位点的耐盐基因更是极其有限，其中SKC1编码一个HKT家族的钠离子转运蛋白，耐盐材料Nona Bokara携带的SKC1优异等位基因序列在+418、+551、+994和+1183处具有4个非同义SNP，从而导致水稻的耐盐性显著提高^{［参考文献 13

百度学术}13］；OsARF18编码一个生长素响应因子，在优异等位基因中+1743、+1830、+1986、+2102处具有4个非同义SNP，增强水稻耐盐性^{［参考文献 14

百度学术}14］。鉴定强耐盐的水稻种质资源，尤其是地方品种资源，确定耐盐基因中具有自然变异的优异单倍型，设计分子标记，聚合优异单倍型创新种质，对于培育耐盐水稻新品种、保障国家粮食安全具有非常重要的意义。本研究对国内外的200多份水稻核心种质进行耐盐鉴定，筛选出强耐盐的种质资源；对水稻中已报导的20个耐盐基因进行单倍型分析，鉴定优异单倍型，开发分子标记并在育种中应用。研究结果为水稻育种提供了基础材料，同时为水稻耐盐育种的分子辅助选择提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究材料为来自水稻3K数据库的236份水稻核心种质，包括79份粳稻、146份籼稻以及11份其他品种材料，来自33个国家，其中160份来自中国，具体来源信息详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20240602001，附表1。这些种质包括部分中国微核心种质^［

15-16］，代表了世界范围内栽培稻种质资源的遗传多样性。用于开发验证分子标记的材料是国内耐盐品种盐丰47、常规粳稻品种农垦57，以及盐丰47与农垦57的重组自交系群体。

表1 236份水稻核心种质的耐盐表型统计

Table 1 Statistical analysis of salt tolerance phenotypes for 236 core rice germplasms

指标 Traits	均值 Mean	标准差 SD	范围 Range	变异系数（%）CV	峰度 Kurtosis	偏度 Skewness
苗期存活天数（d）Seedling survival days	15.97	3.68	9.60~25.49	23.07	-0.39	0.56
苗期耐盐等级Seedling salt-tolerant grade	7.17	1.07	4.60~9.00	14.90	-0.87	-0.03
苗期存活率（%）Seedling survival rate	66	30	0~100	45.36	-0.89	-0.55
大田存活率（%）Field survival rate	81	20	0~100	24.52	3.85	-1.85

1.2 水稻耐盐性鉴定与产量性状调查

将待鉴定种子在50℃烘箱中处理72 h打破休眠。随机挑选饱满的种子放入垫有滤纸的培养皿中，去离子水浸泡，置于30℃培养箱中催芽48 h。待种子发芽后，随机选取健康且生长状态一致的种子（30粒）移至96孔播种板中，使用Yoshida水稻营养液培养2周左右（两叶一心时期），换为含150 mmol/L NaCl的Yoshida水稻营养液培养7~15 d，再用正常的Yoshida水稻营养液水培恢复7~15 d，每个处理3个重复，每个重复30株。观察表型，拍照并统计存活率；随机选取5株测量株高、根长、地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重和地下部干重并取平均值。具体实验方法为用滤纸吸干地上部或地下部表面的水分及附着物，用电子天平称取鲜重，将称取完成的地上部或地下部装入已知重量的容器中，放入烘箱内，在80℃下烘干48 h，烘干后的地上部或地下部取出放入干燥器内，待冷却至室温时，用电子天平称量其干重。耐盐等级调查标准参照《水稻种质资源描述规范和数据标准》^［

17］，具体将耐盐等级分为9级，1级为耐盐性最强，9级最弱。幼苗存活标准按照有绿叶即为存活，幼苗存活率为存活株数与总株数的比值，以3次重复的幼苗存活率的平均值作为统计数据。

大田耐盐试验在山东东营耐盐鉴定基地进行鉴定，每小区面积4.5 m²，种植100株，3次重复。盐胁迫浓度为0.3%~0.5%；正常插秧20 d后调整盐浓度至0.3%，抽穗前调整盐浓度至0.5%，单株完成整个生育期的抽穗、开花、结实为存活，统计存活率。水稻单株产量调查利用在三亚基地南繁季生长的材料，每份材料种植3次重复，每重复4行，取中间2行20株单株测产。

1.3 DNA提取与PCR扩增

采用DNA提取试剂盒（TIANGEN）对水稻叶片进行DNA提取。采用KOD-FX高保真酶进行PCR扩增，PCR扩增体系为50 µL，包括DNA 2 µL（50 ng），引物（正向+反向）各1.5 µL （10 µmol/L ），Buffer 25 µL，ddH₂O 10 µL，dNTP 10 µL。PCR扩增程序为98℃预变性5 min；98℃变性10 s，58℃退火30 s，68℃延伸30 s，35个循环；68℃延伸10 min。PCR反应结束后，取产物于1.0%的琼脂糖凝胶200V电压下电泳分离。

1.4 RNA提取与qRT-PCR分析

利用RNA提取试剂盒（TIANGEN）对试验材料进行RNA提取，然后使用HiScript IV RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（Vazyme）反转录试剂将RNA反转录为cDNA，反转录体系分为两步，第1步体系包含RNase-free ddH₂O 7 μL，5 × gDNA wiper Mix 3 μL，模板RNA 5 μL；反应程序为42℃，2 min。第2步体系包含4 × HiScript IV qRT SuperMix 5 μL，第1步的反应液15 μL；反应程序：37℃ 15 min，85℃ 5 s。利用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）进行qRT-PCR实验，反应体系为20 µL，包括2 × Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，正反向引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA 4 μL，ddH₂O 5.2 μL；反应程序95℃ 15 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环；熔解曲线设定默认为95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s，60℃ 15 s。数据分析采用2^-△△CT法，利用T检验的方法判断显著性。

1.5 单倍型分析

基于Rice SNP-Seek Database网站（https：//snpseekv3.irri-e-extension.com/v2/_download.zul）提供的水稻基因分型数据集3K RG 1M GWAS SNP Dataset下载3024份水稻的SNP数据，根据测序编号利用plink软件包从中提取本研究中用到的236份材料的SNP信息，为保证数据质量和分析结果的准确性，按照样本间SNP缺失率<0.05、次等位基因频率MAF≥0.05进行筛选，共获得338112个SNP 标记用于提取材料中耐盐基因编码区的多态性SNP位点；利用Launch DnaSP6软件进行单倍型分析。

1.6 分子标记开发

根据单倍型分析以及亲本盐丰47和农垦57基因序列比对的结果，确定优势单倍型携带的特有变异位点，并针对这些位点开发分子标记。本研究开发了AKT1、MYB48、HKT1这3个基因的分子标记。根据存在的SNP位点，利用Primer Premier 3软件设计引物，开发扩增片段在100~300 bp的SNP分子标记。在KASP分子标记开发中，根据目的SNP位点上下游各100 bp的DNA序列，利用网站https：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/设计3条分子标记引物，包括一条反向通用引物，两条正向特异性引物，正向引物3′端为SNP位点，5′端加上2种检测探针序列，扩增产物长度一般为70~150 bp。

1.7 分子标记分析

对于KASP分子标记，PCR扩增体系为50 µL，包括DNA 2 µL（50 ng），引物（正向+反向）各1.5 µL （10 µmol/L），Buffer 25 µL，ddH₂O 10 µL，dNTP 10 µL。扩增程序为：预变性阶段95℃反应15 min；循环阶段95℃变性10 s，65℃~55℃退火延伸60 s（每个循环降低1℃，10个循环后退火延伸温度保持在55℃），95℃ 10 s，57℃ 60 s，30个循环；然后对PCR产物进行荧光值检测（PHERAstar PLUS 酶标仪），并根据荧光检测结果判断基因型。

对于SNP分子标记，PCR反应为采用KOD-FX高保真酶进行PCR扩增，PCR扩增体系同KASP分子标记。PCR扩增程序为98℃预变性5 min；98℃变性10 s，58℃退火30 s，68℃延伸30 s，35个循环；68℃延伸10 min。PCR产物利用1.0%的琼脂糖凝胶200 V电压下电泳分离，观察并记录每个样品的带型。

2 结果与分析

2.1 水稻核心种质耐盐鉴定

水稻核心种质群体苗期与大田耐盐性鉴定统计结果如表1所示。群体耐盐性存在较大的变异幅度，其中苗期存活率变异系数最大，为45.36%。筛选出一份来自澳大利亚的籼稻种质‘71011’，苗期存活率100%，苗期存活天数25.5 d，苗期耐盐等级5.2，大田耐盐存活率100%，均为群体材料中的最高值，可作为强耐盐种质应用于我国水稻育种。此外，综合评价苗期耐盐指标以及大田耐盐存活率，筛选出强耐盐的种质5份和盐敏感种质5份，详细信息列于表2。筛选出的5份强耐盐种质可用于我国水稻育种，5份盐敏感种质可用于找寻新的耐盐基因或耐盐机理。同时将236份水稻种质做了耐盐综合评估并排序，前20名定义为耐盐种质，后20名定义为盐敏感种质，用于后续研究。

表2 236份水稻核心种质中筛选出的强耐盐种质和盐敏感种质的耐盐表型统计

Table 2 Statistical analysis of salt-tolerant phenotypes of the strong salt-tolerant and salt-sensitive rice germplasms selected from 236 core rice germplasms

种质类型 Germplasm type	品种名 Name	地区 Origin	分组 Group	苗期存活天数（d）Seedling survival days	苗期耐盐等级Seedling salt-tolerant grade	苗期存活率（%） Seedling survival rate	大田存活率（%） Field survival rate	大田耐盐等级Field salt-tolerant grade
强耐盐种质 Strongly salt-tolerant germplasm	71011	澳大利亚	XI-1A	25.50	5.2	100	100	3.4
	加巴拉	孟加拉	XI-1A	22.15	5.4	100	81	4.2
	湘晚籼3号	中国	XI-adm	24.90	5.6	100	100	5.0
	镇籼232	中国	XI-1A	25.10	4.6	100	87	4.2
	献改B	中国	XI-adm	24.40	6.1	100	93	5.0
盐敏感种质 Salt-sensitive germplasm	CHANH 148	越南	XI-adm	10.10	9.0	2.8	0	9
	秕五升	中国	XI-adm	9.80	9.0	2.0	0	9
	光壳香糯	中国	GJ-tmp	9.60	9.0	1.0	0	9
	一支香	中国	GJ-tmp	9.60	9.0	1.0	5.0	8.5
	高丽秋	朝鲜	GJ-tmp	10.40	9.0	0	0	9

2.2 水稻耐盐基因单倍型分析

通过查询国家水稻数据库（http：//www.ricedata.cn/gene/），目前发掘到的水稻耐盐相关基因共约300个，分布于12条染色体上。选取已有相关文献报道、具有耐盐功能以及耐盐调控机理清晰的20个基因（详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20240602001，附表2），作为下一步研究的目标。从3K数据库中提取236份核心种质中20个基因的基因组序列，包括编码区序列、启动子区序列（2-kb 5′UTR）、1-kb 3′UTR。筛选在前20名耐盐种质和后20名盐敏感种质间产生明显的分型的基因，随后对236份核心种质进行这些基因的序列比对和单倍型分析，与耐盐相关联的单倍型命名为Hap-A，盐敏感相关联的单倍型命名为Hap-B。其中，AKT1^［

18］、CPK12^{［参考文献 19

百度学术}19］、 MYB48^{［参考文献 20

百度学术}20］、P5CS1^{［参考文献 21

百度学术}21］、SIK1^{［参考文献 22

百度学术}22］、 SKC1^{［参考文献 23

百度学术}23］、 SNAC1^{［参考文献 24

百度学术}24］、HKT1^{［参考文献 25

百度学术}25］，这8个基因存在与耐盐性状相关联的单倍型，其他基因未找到与耐盐相关联的单倍型。这8个基因的单倍型在236份种质中的分布如图1所示。

图1 8个耐盐基因在236份核心种质群体中的单倍型分布

Fig. 1 Distribution of haplotypes of eight genes in 236 rice core germplasm

2.3 耐盐基因分子标记开发

选择强耐盐水稻品种盐丰47（YF47），普通品种农垦57（NK57）作为亲本，测序鉴定上述20个耐盐相关基因在两亲本间的序列差异位点。结果表明，在这两份育成品种中，AKT1、HKT1、MYB48、ONAC022^［

26］、HAK5^{［参考文献 27

百度学术}27］、CPK12、NHX1^{［参考文献 28

百度学术}28］这7个基因存在可能影响其功能的变异位点。其中，AKT1在启动子区存在多个InDel，MYB48在启动子区域存在1个12 bp的InDel，HKT1在编码区存在3个非同义突变的SNP（图2A），CPK12在编码区只存在1个SNP位点的非同义突变，ONAC022、HAK5、NHX1三个基因变异位点位于非编码区。为了验证AKT1、MYB48这两个基因启动子区的变异是否对基因表达量产生影响，对盐处理下的亲本材料进行AKT1、MYB48基因的表达量分析。结果显示，盐胁迫处理前，两个基因的表达量在YF47与NK57中均没有显著差异，处理2~4 h后，AKT1在YF47中的表达量极显著高于NK57。而MYB48则相反，盐处理后在NK57中的表达量极显著高于YF47（图2B）。鉴于AKT1 与MYB48都是正调控耐盐的基因，将高表达量的基因型定义为耐盐基因型，即AKT1的YF47基因型定义为耐盐基因型，MYB48的NK57基因型定义为耐盐基因型，HKT1的YF47基因型为耐盐基因型。

图2 三个基因序列在两亲本间的变异位点及表达量分析

Fig. 2 Variations and transcriptional patterns of three genes in both parents

A：AKT1、MYB48和HKT1在两亲本间的变异位点分布，其中--代表该位置碱基缺失，红色碱基代表两亲本间变异位点；B：AKT1和MYB48在两亲本间的表达量模式，20 d幼苗分别在150 mmol/L NaCl处理0、 0.5、 2、 4、 8 h后提取叶片RNA， ns：无显著差异， *：在P< 0.05水平差异显著， ***：在P<0.001水平差异极显著，下同

A：Variation site distribution of AKT1， MYB48 and HKT1 between the two parents， where ‘--’ represents base deletion at that position，the red nucleotide base represents variation site； B：Expression patterns of AKT1 and MYB48 in two parents under salt treatments. 20-days seedlings were treated with 150 mmol/L NaCl， RNA was extracted after treatments 0， 0.5， 2， 4， 8 hours respectively. ns：No significant difference， *：Significant difference at P<0.05 level， ***：Extremely significant difference at the P<0.01 level， the same as below

根据在核心种质中鉴定的存在优异单倍型的基因，以及YF47、NK57之间的基因型差异，最终选择启动子区有变异且表达量差异显著的AKT1、MYB48，以及编码区有非同义突变的HKT1用以开发SNP分子标记和KASP分子标记（表3）。AKT1、HKT1的SNP分子标记引物在NK57中分别扩增出278 bp、238 bp的条带，而YF47中不能扩增出条带。MYB48分子标记引物在YF47中扩增出253 bp条带，而在NK57中不能扩增出条带。琼脂糖凝胶电泳结果表明，3个分子标记多态性良好，均可以用于区分双亲基因位点的基因型（图3A）；KASP分子标记中，亲本间均呈现差异分型结果（图3B）。

表3 分子标记引物序列信息

Table 3 Sequence information of molecular markers developed in this study

引物名称Primer name	引物序列（5′-3′）Primer sequence（5′-3′）
AKT1-S-F1	CCGATTCGTCGCCGCCCAGC
AKT1-S-R1	CACAAGGCCCACAAATCTGG
MYB48-S-F1	TCAACGTCACAACAAATCTA
MYB48-S-R1	AGCAAGTATCAAGGTTAGTA
HKT1-S-F1	CAAGTAGTAAGATCCACATC
HKT1-S-R1	CGGCTTGTCCTGGCAGATGC
AKT1-FAM1	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTAAATATGATAACTTGGAATTCTGCAGG
AKT1-HEX1	GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCTAAATATGATAACTTGGAATTCTGCAGT
AKT1-COM1	TGTTCGAACTGTGAATAGCTGAGG
MYB48-FAM1	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCATCGCCCAAGAGCATG
MYB48-HEX1	GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCATCGCCCAAGAGCATT
MYB48-COM1	GCCAGTAGTTCTTGATCTCGTTGTC
HKT1-FAM1	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCAAGCCAAGTAGTAAGATCCACATT
HKT1-HEX1	GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCAAGCCAAGTAGTAAGATCCACATC
HKT1-COM1	TGTCTTCTGAAAGATTCTGAGGTGTC

图3 AKT1、MYB48和HKT1分子标记开发验证

Fig. 3 Development and validation of molecular markers of AKT1， MYB48 and HKT1

A：3个基因SNP标记引物的PCR产物电泳检测， T1~T6为盐丰47（YF47）/农垦57（NK57）重组自交系；B：3个等位基因的KASP标记分型，图中每个圆点代表一个样品，蓝色圆点表示该基因携带HEX标签序列，红色表示该基因携带FAM标签序列，黑色圆点为空白对照

A：PCR product electrophoresis detection of 3 gene SNP marker primers， T1-T6 is a recombinant inbred lines of YF47/NK57， M： Marker；B：KASP marker typing of 3 alleles. Each dot in the figure represents a sample， the blue dots indicate that the gene carries a HEX tag sequence， red indicates that the gene carries the FAM tag sequence， black dots are blank controls

2.4 耐盐分子标记应用及耐盐新种质创制

构建YF47/NK57重组自交系至F₆，对30份重组自交系进行SNP分子标记鉴定，如图3A所示，T1、T2、T3中AKT1与YF47条带一致，MYB48与NK57条带一致，HKT1与YF47条带一致，均为耐盐基因型。T4、T5、T6株系中，3个基因全部为非耐盐基因型（图3A）。在KASP分子标记基因分型验证中，基因AKT1中YF47、T1、T2、T3为一种分型，NK57、T4、T5、T6为另一种分型；基因MYB48中NK57、T1、T2、T3为一种分型，YF47、T4、T5、T6为另一种分型；基因HKT1中YF47、T1、T2、T3为一种分型，NK57、T4、T5、T6为另一种分型，结果与SNP分子标记鉴定结果相一致（图3B）。随后，对6个株系进行了苗期耐盐鉴定，如图4所示，T1~T3与T4~T6耐盐性差异极显著，T1~T3表现出了比耐盐亲本YF47更强的耐盐性，苗期盐处理后的存活率、株高、根长、地上部鲜重与干重、地下部的鲜重与干重，都高于耐盐亲本YF47。与之相反的是，T4、T5、T6这3个株系耐盐能力显著下降，各种耐盐指标均低于YF47，部分指标低于NK57。同时，将上述T1~T6株系盐处理后，检测了AKT1、MYB48基因的表达量，qRT-PCR结果显示，在耐盐株系T1、T2和T3中，AKT1基因表达模式与YF47趋于一致，而MYB48基因表达模式与NK57趋于一致（图5A）。在正常栽培条件下对T1~T3耐盐株系进行产量测试，3个株系除T1株系外，其他株系的单株产量与高产亲本YF47相比，并未有显著的变化（图5B）。

图4 盐丰47与农垦57重组自交系耐盐表型鉴定

Fig. 4 Salt tolerance identification of six recombinant inbred lines from Yanfeng47 and Nongken57

A：YF47、NK57及6个株系耐盐表型；B~G：YF47、NK57及6个株系NaCl处理后复水7天后耐盐相关表型调查，T1-T6为盐丰47（YF47）/农垦57（NK57）重组自交系，**：在P< 0.01水平差异极显著

A：Salt tolerance phenotypes of YF47， NK57， and 6 lines；B-G：Phenotypic investigation related to salt tolerance of YF47， NK57， and 6 other strains following 7 days of recovery after NaCl stress，T1-T6 is a recombinant inbred line of YF47/NK57， **：Extremely significant difference at the P<0.01 level

图5 AKT1和MYB48在6个重组自交系中的表达模式以及耐盐株系T1~T3田间单株产量统计

Fig. 5 The expression patterns of AKT1 and MYB48 in 6 recombinant inbred lines and yield statistics of salt tolerant T1-T3 plants in the field

A：AKT1和MYB48基因在两亲本和6个重组自交系中的表达模式，20 d幼苗150 mmol/L NaCl分别处理0、0.5、2、4、8 h；B：盐丰47与农垦57，以及3个耐盐株系T1~T3在田间的单株产量统计，样本数>20株，各株系单株产量与高产亲本盐丰47比较的P值列于上方

A：The expression patterns of AKT1 and MYB48 genes in two parents and six recombinant inbred lines. After 20 days of treatment with 150 mmol/L NaCl at 0， 0.5， 2， 4， and 8 h；B：The yield statistics of Yanfeng 47 and Nongken 57， as well as three salt tolerant plant lines T1-T3 in the field， showed a sample size of more than 20 plants. The P-values of the yield comparison between each plant line and its high-yielding parent Yanfeng 47 are listed above

3 讨论

随着我国盐渍化土地的不断增加，培育耐盐碱水稻新品种越发重要。目前，国内外创制的耐盐水稻材料很多，但生产中的绝大多数品种耐盐性并不高^［

29］。其原因就在于抗逆性状往往与产量以及高品质性状负关联，强耐盐品种的其他产量性状并不突出。而大面积推广的育成品种中，强耐盐的品种并不多，难以满足高盐碱地块的种植需求。优异的地方品种资源是水稻耐盐遗传改良的基础^{［参考文献 30-31}30-31］。在本研究中，对来自全球的236份水稻核心种质进行了耐盐鉴定，包括在0.3%~0.5%盐胁迫下的大田全生育期耐盐鉴定。筛选出了一批综合耐盐能力强的种质，这些种质既有中国的地方品种，也有来自国外的品种。尤其是一份来自澳大利亚的强耐盐种质，耐盐表型稳定且突出。本研究鉴定的水稻种质为我国水稻耐盐育种提供了可利用的材料。同时筛选出耐盐机制研究清楚的20个基因，在236份核心种质中进行单倍型分析，通过与耐盐鉴定结果关联，发现其中有8个基因可能存在优异单倍型。这些基因的优异单倍型为聚合耐盐基因提供了基本的数据信息，虽然其耐盐功能仍需要进一步的验证。

本研究选择了两个亲本品种，对耐盐基因优异单倍型进行验证并开发分子标记。盐丰47是目前水稻生产中推广面积较大的耐盐品种^［

32］。农垦57为20世纪60-70年代育成的老品种，在现在水稻生产中已经基本上淘汰，该品种具有高品质、抗病等优良特征，但对盐胁迫敏感、产量偏低^{［参考文献 33

百度学术}33］。通过比较以上20个基因在两品种之间的序列差异，有7个基因存在可能影响功能的变异位点，与以上在核心种质群体中鉴定的可能存在优异单倍型的8个基因有4个基因重合，即AKT1、HKT1、MYB48和CPK12，而CPK12只存在1个SNP的变异，因此选择了AKT1、HKT1、MYB48这3个基因开发分子标记。据报道，AKT1是一种shaker家族钾离子通道蛋白，过表达AKT1会通过增加组织中特别是根中的K⁺水平，提高水稻对盐胁迫的耐受性^{［参考文献 34-35}34-35］。HKT1编码一个高亲和Na⁺转运蛋白，正向调控水稻耐盐^{［参考文献 25

百度学术}25］。MYB48是一个MYB转录因子，通过调节胁迫诱导的ABA合成，在水稻耐旱性和耐盐性上起着重要作用^{［参考文献 20

百度学术}20］。AKT1与MYB48均在启动子区存在变异位点，且显著影响其在盐胁迫下的表达量。有意思的是，在150 mmol/L NaCl处理条件下MYB48在农垦57中的表达量显著高于盐丰47，已有很多的研究报道MYB48是正调控水稻耐盐的转录因子^{［参考文献 20

百度学术}20］，这个结果说明，即使在农垦57这样耐盐能力并不强的老品种里，也可能存在耐盐基因的优异基因型。本研究构建的重组自交系证实了这一点：在3个强耐盐株系中，这3个基因的基因型均为耐盐基因型，而3个盐敏感株系中这3个基因的基因型均为盐敏感基因型。结果表明本研究开发的分子标记可用于耐盐育种中分子标记辅助选择。

本研究中聚合了AKT1、HKT1、MYB48三个基因优异基因型的3个株系T1、T2、T3，其耐盐程度高于盐丰47，且单株产量性状并未受到影响。下一步将进一步进行盐胁迫下的大田产量试验，以及测定3个株系的稻米品质等性状，这3个株系作为创新种质，既可以用作育种改良的中间材料，也可以作为耐盐的新品系在生产中推广应用。

4 结论

本研究通过对国内外的236份水稻核心种质进行苗期、大田耐盐鉴定，筛选出一批耐盐种质，包括一份强耐盐的来自澳大利亚的水稻新种质。通过筛选已报道耐盐基因的优异单倍型，开发了AKT1、HKT1、MYB48的分子标记，并利用耐盐品种盐丰47与常规品种农垦57构建重组自交系，聚合耐盐基因的优异基因型，创制了3个强耐盐的新品系。本研究为水稻耐盐育种提供了可利用的品种资源、分子标记以及创新种质。

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