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SSR分子标记在杜鹃花属植物中的研究进展  PDF

  • 姚姚 ✉
  • 张浩
  • 王秀云
  • 夏宜平
  • 周泓 ✉
浙江大学农业与生物技术学院/观赏植物基因组与基因工程实验室，杭州310058

最近更新：2025-03-07

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240621002

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摘要

杜鹃花是中国十大名花之一，观赏价值极高，深受人们喜爱。杜鹃花属内物种数量多、种间自然杂交频繁、部分种类园艺化程度很高，且品种命名不统一，使得国家和地区间的品种交流受到一定影响。SSR标记在种质鉴定、遗传多样性分析、分子标记辅助育种等方面具有优势。本文综述了近20年来SSR标记在杜鹃花属植物中的研究进展。目前，利用各类生物数据库信息、二代测序技术，及其他方法开发杜鹃花属SSR标记共约509对，部分标记在近缘物种中的引物通用性在50%到100%不等。在杜鹃花属物种保护方面，SSR标记被应用于物种保护策略研究、交配系统研究和基因交流研究，为物种遗传多样性保护提供科学依据。SSR标记还被应用于杜鹃花属杂交后代真实性鉴定和性状-标记关联分析等方面，在叶片褪绿和花色等性状上展开研究。对未来SSR标记的应用前景进行了展望，在以杜鹃花属濒危物种为重点大力开发属内SSR标记、开展重要性状关联辅助育种、构建DNA指纹图谱加强品种鉴定等方面深入研究，以期为杜鹃花属植物的研究、保护和遗传育种提供参考。

杜鹃花是杜鹃花科（Ericaceae）杜鹃花属（Rhododendron L.）植物的总称，属常绿或落叶灌木，是我国十大传统名花之一，与龙胆花（Gentiana L.）、报春花（Primula L.）合称为中国三大天然名花和世界三大高山花卉［

1］，观赏价值极高。目前，全世界记载的杜鹃花有1200余种［2］，全球杜鹃花品种已经超过3万个［3］。我国杜鹃花属种类丰富，有734种，其中464种为特有种［4］。杜鹃花在我国分布广泛，除新疆和宁夏外，其他省份均有分布。因为杜鹃花属植物部分种类种间自然杂交频繁［5］，且各地区品种命名不统一、品种形态有所差异，造成杜鹃花品种较为混乱，在一定程度上限制了其在育种、品种交流传播等方面的发展，使得我国杜鹃花园艺化程度与国外有明显差距，对产业发展较为不利。

简单序列重复（SSR，simple sequence repeat），亦被称作微卫星（Microsatellite），为基因组中由1~6个核苷酸组合而成的基本单位进行多次重复从而构成的一段DNA序列。SSR分子标记以其共显性、所需DNA用量少、操作简单、数量丰富、种属间具有很强的通用性和多态性、实验重复性好等优点，在杨树（Populus L.）［

6］、彩叶香樟（Cinnamomum camphora Nees）［7］、楠木（Phoebe zhennan S. K. Lee & F. N. Wei）［8］等林木，玉米（Zea mays L.）［9］、小麦（Triticum aestivum L.）［7］、甘蔗（Saccharum officinarum L.）［10］等农作物的相关研究中被广泛使用，后来逐渐运用在观赏植物的研究中，如石斛（Dendrobium Sw.）［11］、非洲菊（Gerbera jamesonii Bolus）［12］、紫云英（Astragalus sinicus L.）［13］、绣球（Hydrangea macrophylla （Thunb.） Ser.）［14］，应用方向主要集中在遗传多样性分析、基因定位及分子标记辅助育种、遗传图构建及种子纯度和真伪鉴定等方面［15］。

SSR技术最早在1991年由Moore等［

16］提出，首次在杜鹃花属植物上应用是在1998年Naito等［17］用于R. metternichii Sieb. et Zucc. var. hondoense Nakai的微卫星的分离和鉴定。1998-2023年，关于杜鹃花属SSR分子标记的文章共计约70篇。根据发文量可分成两个阶段：1998-2016年，杜鹃花属相关的SSR研究较少，可利用的SSR标记也较少；2016-2023年随着高通量测序技术的成熟，以及基因组、转录组学的发展，杜鹃花属SSR标记的开发及相关研究逐渐增多。本文对SSR标记在杜鹃花属中的开发方法、标记数量，及其在物种保护、杂交后代真实性鉴定、性状-标记关联分析中的相关研究进行总结，以期为今后杜鹃花属植物的研究、保护和遗传育种提供参考。

1 杜鹃花属SSR标记的开发情况

1.1 基于生物数据库信息开发EST-SSR标记

根据来源可将SSR分为基因组SSR和表达序列标签SSR（EST-SSR，expressed sequence tag-simple sequence repeat），EST-SSR主要是从NCBI公共数据库中下载杜鹃花的相关表达序列进行筛选并开发引物。

王书珍等［

18］从NCBI数据库中的1323条杜鹃花EST序列中分析得到65个SSR位点，SSR出现频率为7.1272％。Li等［19］从杜鹃（R. simsii Planch.）的EST序列中开发了7对新的EST-SSR标记，并对来自湖北桂峰山的32份野生杜鹃花样品进行遗传多样性分析，每个位点的等位基因数为4.43。李美芹等［20］从2535条杜鹃花EST序列中搜索到435个SSR位点，其中14个SSR位点具有多态性，平均等位基因数3.8个。龚记熠等［21］利用NCBI数据库中杜鹃花属基因组和EST序列，第一次对SSR位点特征进行系统分析，共检索出SSR位点2698个，平均密度为1.19个/kb，共设计出引物1643对，占总位点数的60.89%。Sharma等［22］从椭圆叶杜鹃（R. catawbiense Michx.）和白花杜鹃（R. mucronatum var. Ripense （Makino） E.H. Wilson）中发现了168条EST-SSR序列可用于开发引物，随机选取的30对引物中有26个SSR标记（86.66%）能够较好地可重复扩增。这与茶树（Camellia sinensis L. Kuntze，为84.2%［23］）、小麦（为60.8%［24］）、百合（Lilium L.，为78.26%［25］）等物种的可用率近似，说明EST序列中SSR标记的分布在物种间具有一定的相似性，且标记开发可用率较高，可以为杜鹃花属的遗传多样性分析、品种鉴定等研究提供有效的手段。

1.2 基于二代测序技术开发SSR标记

随着以Illumina公司的Solexa、ABI公司的SOLiD和Roche公司的454焦磷酸法测序技术为代表的高通量测序技术［

26］的发展，将基因组学的研究带入了一个新的时期［27］，推动了非模式植物的全基因组测序工作［28］。杜鹃花属植物DNA序列信息获取更加容易，极大方便了SSR标记的开发，相关SSR的开发也转向基于基因组和转录组测序进行。

Delmas等［

29］和Pan等［30］利用二代测序技术在欧洲杜鹃（R. ferrugineum L.）和都支杜鹃（R. shanii Fang）上分离得到微卫星位点，并设计引物进行扩增，每个位点的平均等位基因数在1~20之间。周晓君等［31］、陈凯云等［32］、杨彬［33］和刘梦露等［34］利用简化基因组测序（RAD-seq， restriction-site associated DNA sequence）技术或lllumina HiSeq测序技术分别对灵宝杜鹃（R. henanense subsp. Lingbaoense Fang）、红马银花（R. vialii Delavay & Franch.）、云锦杜鹃（R. fortunei Lindl.）和羊踯躅（R.molle （Blume） G. Don）进行基因组测序和SSR标记开发，每个位点的平均等位基因数在5.25~8.70之间。李太强等［35］、Zhang等［36］、张越［37］、王华等［38］利用高通量测序平台对长梗杜鹃（R. longipedicellatum L. Cai & Y. P. Ma）、大王杜鹃（R. rex H. Lév.）、2年生杜鹃花白凤4号（R. pulchurum Planch（“BaiFeng 4”variety））叶片进行转录组测序，检测到SSR的出现频率分别为31.30%、9.32%、20.73%。Xing等［39］、陈明辉等［40］利用Illumina测序技术对鹿角杜鹃（R. latoucheae Franch.）、杜鹃花品种（R. hybridum Hort）的茎、叶、茎尖、花蕾、花和幼果的混合物进行测序，设计并筛选出EST-SSR进行扩增，每个位点的等位基因数在2~13个。王书珍等［41］采用RNA-seq技术对‘紫鹤’（R. pulchrum Planch （“Zihe”variety））品种的花蕾进行转录组测序，开发出13对多态性良好的SSR标记，平均每个位点有效等位基因数在1.684~5.930。王书珍等［42］还利用RNA‑seq技术对羊踯躅花瓣进行转录组测序，筛选并得到30对EST-SSR引物。

测序技术的发展为杜鹃花属植物基因表达和调控的研究提供了新视角，从早期的454焦磷酸测序技术到第三代高通量测序技术，杜鹃花属SSR标记的开发得到了极大的推动，测序材料也从单一的叶片拓展至其他器官。利用开发的SSR标记对不同种群或个体进行遗传多样性分析，平均等位基因数在1.5~20.0，这反映了杜鹃花属内不同种类或种群间的遗传差异和进化潜力。

1.3 其他方法开发SSR分子标记

在全基因组测序技术被大规模应用之前，基因文库探针富集是一种常用的基因组分析方法，早期（1999-2010年）杜鹃花属SSR标记的开发就使用该方法，如Naito等［

17］利用R. metternichii Nakai基因组文库探针富集开发7对SSR多态性引物。Dendauw等［43］利用富集法在2种杜鹃（R. simsii hybrid Mevr. Van Belle和 R.simsii Daoxian）中开发了8对标记引物，其中6对有较好的扩增效果和多态性。Wang等［44］利用基因组文库探针富集的方法在马缨杜鹃（R. delavayi Franch.）中开发了15对SSR引物并进行了多态性分析。Wang 等［45］利用该方法在美容杜鹃（R. calophytum Franch.）上开发了15对SSR引物。Wang等［46］从大白杜鹃（R.decorum Franch.）中开发了24对多态性良好的SSR引物。

磁珠富集法（FIASCO， fast isolation by AFLP sequences containing repeats）是一种通过扩增含有重复序列的AFLP标记，快速分离和鉴定DNA的方法，该方法也适用于SSR标记的开发，如Li等［

47］从濒危物种牛皮杜鹃（R. aureum Franch.）中开发了12个EST-SSR标记，与从GenBank数据库中筛选出的7个EST-SSR标记共19个标记，对3个牛皮杜鹃种群进行扩增，每个标记的等位基因数为1~8个。王书珍等［48］构建了杜鹃的（AG）n微卫星富集文库，并筛选出39个序列供后续引物开发使用。Tan等［49］从杜鹃中分离并鉴定了8个微卫星位点。

生物素-链酶亲和素捕获方法［

50］是一种基于生物素与链霉亲和素间高特异性和强亲和力的生物分子捕获技术。Liu等［51］基于此方法开发了16个多态性和7个单态性微卫星引物，利用这16个多态位点对来自中国3个群体的89个马银花（R. ovatum （Lindl.） Planch. ex Maxim.）个体进行了进一步的研究，每个位点的等位基因数在4~30之间。Choudhary等［52］用该方法从树形杜鹃（R.arboreum Sm.）中开发了38个位点，在3个树形杜鹃种群中扩增，等位基因数在2~14之间。

1.4 引物通用性检测

SSR标记通常在近缘物种中具有较高的通用性，转移近缘物种的SSR标记已成为遗传信息缺乏物种的一种便捷、高效的分子标记开发方法［

53］。开展通用性检测有利于丰富基因组信息较少的物种的SSR数据库［54］，提高引物利用效率，加速物种的遗传多样性、亲缘关系以及近缘种内和近缘种间的物种起源与演化分析。

Wang等［

44］研究了从马缨杜鹃开发的SSR标记在大白杜鹃和迷人杜鹃（R. agastum Balf. f. & W. W. Sm.）中的跨物种扩增。Wang等［46］发现从大白杜鹃开发的24对SSR引物有12对能在8个杜鹃花属物种中具有多态性。王书珍等［55］发现前期开发的7个杜鹃SSR标记能够在4个杜鹃花近缘种中跨物种扩增。张露等［56］综合利用椭圆叶杜鹃EST数据库、杜鹃和马缨杜鹃基因组，在12份差异较大的高山杜鹃野生种和杂交种的材料中筛选得到26个通用性良好的SSR引物。Pan等［30］发现24个都支杜鹃微卫星位点中的大部分能在8个同属物种中扩增出条带。从马缨杜鹃和大白杜鹃开发的38个微卫星位点［57］在杜鹃花属不同组的6个物种中通用性在55%~89%。从牛皮杜鹃中开发16个EST-SSR和SSR［47］在兴安杜鹃（R. dauricum L.）、短果杜鹃（R. brachycarpum D.Don ex G.Don）中的通用性大约在84.2%。Zhang等［36］、张越［37］发现从大王杜鹃开发的36对EST-SSR标记在6个亚属18个物种中具有58.33%~83.33%的通用性。在鹿角杜鹃中开发的EST-SSR多态性引物［39］在37种杜鹃中显示出100%的通用性。从‘紫鹤’中开发的13对SSR标记［40］在30个杜鹃样品中的通用性为100%。32个从杜鹃［58］、椭圆叶杜鹃和白花杜鹃［22］中开发的EST-SSR在不同的亚属和组中的通用性在59.38%~93.75%。从云锦杜鹃开发的25对SSR引物［33］在其他31种不同杜鹃花属植物（或品种）中的通用性较好，达到78.13%。

杜鹃花属的SSR标记开发研究显示（表1），常绿杜鹃亚属是开发和应用最多的亚属，共开发了287对SSR引物。马银花亚属与映山红亚属的开发均有一定的积累，分别开发了61对和50对。羊踯躅亚属研究相对较少，但引物数较高，达到50对。杜鹃亚属中的开发相对较弱，仅有9对引物。还有一些不确定亚属但在实验中进行应用的SSR引物，如陈明辉等［

40］开发的引物，总体而言具有一定使用价值的杜鹃花属SSR引物约509对。杜鹃花属SSR的跨物种扩增已经拓展为跨亚属间通用性检测，但杜鹃花科范围内的通用性检测仅有Delmas等［29］在杜鹃花科另外两个物种黑果越橘（Vaccinium myrtillus L.）和长穗石南（Erica scoparia L.）上进行过尝试。从杜鹃花属开发的SSR标记在近缘物种中的通用性在50%~100%，其中EST-SSR的通用性介于58.33%~100%之间。亚属间较高的通用性表明利用亚属内重点种质开发SSR标记，就可进行属内近源物种的系统发育、物种进化及亲缘关系等的研究。

表1  杜鹃花属SSR标记的开发情况统计（按亚属分类）
Table 1  Statistics on the development of SSR markers in the genus Rhododendron （by subgenus）

亚属

Subgen

开发SSR对象

Sources of SSR

数量

Number

类型

Type

应用

Application

常绿杜鹃亚属

Subgen. Hymenanthes

梅特尼氏杜R. metternichii Nakai 7对［17］ SSR

基因组文库探针富集法开发、

交配系统研究

椭圆叶杜鹃R. catawbiense Michx. 12对［22］ EST-SSR 生物数据库信息开发标记
大王杜鹃R. rex H. Lév. 36对［36-37］ EST-SSR 二代测序技术开发标记、通用性研究
都支杜鹃R. shanii Fang 24对［30］ SSR 二代测序技术开发标记、通用性研究
锦绣杜鹃”紫鹤”品种R. pulchrum Planch （“Zihe”variety） 13对［41］ EST-SSR 二代测序技术开发标记、通用性研究
灵宝杜鹃R. henanense subsp. Lingbaoense Fang 15对［31］ SSR 二代测序技术开发标记、序列特征分析
云锦杜鹃R. fortunei Lindl. 32对［59］ EST-SSR 二代测序技术开发标记、序列特征分析、通用性研究
马缨杜鹃R. delavayi Franch. 15对［44］ SSR

基因组文库探针富集法开发、

通用性研究

美容杜鹃R. calophytum Franch. 15对［45］ SSR

基因组文库探针富集法开发、

杂交后代的真实性鉴定

大白杜鹃R. decorum Franch. 24对［46］ SSR 基因组文库探针富集法开发、通用性研究
牛皮杜鹃R. aureum Franch. 12对［47］ EST-SSR FIASCO法开发标记、通用性研究

常绿杜鹃亚属

Subgen. Hymenanthes

毛脉杜鹃R. pubicostatum T. L. Ming 12对［60］ SSR 基因交流研究
锈红杜鹃R. bureavii Franch.
川西杜鹃R. sikangense Fang
NCBI数据库椭圆叶杜鹃R. catawbiense Michx. 14对［56］ EST-SSR 生物数据库信息开发标记、通用性研究、杂交后代真实性鉴定-推测亲本
马缨杜鹃R. delavayi Franch. 6对［56］ SSR 通用性研究、杂交后代真实性鉴定-推测亲本
树形杜鹃R. arboreum Sm. 38对［52］ SSR 生物素-链酶亲和素捕获法开发
翘首杜鹃R. protistum Balf. f. & Forrest 10对［61］ SSR 物种保护策略
Rhododendron Cunningham′s White 2对［62］ SSR 性状-标记关联分析（叶片退绿和花色）

马银花亚属

Subgen. Azaleastrum

鹿角杜鹃R. latoucheae Franch. 37对［39］ EST-SSR 二代测序技术开发标记、通用性研究
红马银花R. vialii Delavay & Franch. 8对［32］ SSR 二代测序技术开发标记、物种保护-保护策略
马银花R. ovatum （Lindl.） Planch. ex Maxim. 16对［51］ SSR 生物素-链酶亲和素捕获法开发

映山红亚属

Subgen. Tsutsusi

杜鹃R. simsii hybrid Mevr. Van Belle和

R. simsii Daoxian

6对［43］ SSR

基因组文库探针富集法开发、

序列特征分析

白花杜鹃R. mucronatum var. Ripense （Makino） E.H. Wilson 14对［22］ EST-SSR 生物数据库信息开发标记
NCBI数据库杜鹃R. simsii Planch. 7对［19］ EST-SSR 生物数据库信息开发标记
杜鹃R. simsii Planch. 8对［49］ SSR FIASCO法开发标记
NCBI数据库杜鹃R. simsii Planch. 14对［58］ EST-SSR 生物数据库信息开发标记、遗传多样性、通用性研究
NCBI数据库杜鹃R. simsii Planch. 1对［56］ EST-SSR 生物数据库信息开发标记、通用性研究、杂交后代真实性鉴定-推测亲本
杜鹃［48］R. simsii Planch. / / FIASCO法开发标记

羊踯躅亚属

Subgen. Pentanthera

杜鹃花白凤4号［

38］

R. pulchurum Planch（“BaiFeng 4”variety）

/ / 二代测序技术开发标记、序列特征分析
黄杜鹃/羊踯躅R. molle （Blume） G. Don 30对［42］ EST-SSR 二代测序技术开发标记
羊踯躅R. molle （Blume） G. Don 20对［34］ SSR 二代测序技术开发标记

杜鹃亚属

Subgen. Rhododendron

欧洲杜鹃R. ferrugineum L. 9对［29］ SSR 二代测序技术开发标记、通用性研究、物种保护-交配系统研究
长梗杜鹃［35］R. longipedicellatum L. Cai & Y. P. Ma / SSR 二代测序技术开发标记、序列特征分析
/ 杜鹃花种质资源R. hybridum Hort 21对［40］ EST-SSR 二代测序技术开发标记
/ NCBI数据库 14对［20］ EST-SSR 生物数据库信息开发标记
/ NCBI数据库 1643对［21］* EST-SSR 生物数据库信息开发标记、序列特征分析
/ GenBank数据库 7对［47］ EST-SSR 生物数据库信息开发标记、通用性研究
/ / 10对［63］ SSR 杂交后代的真实性鉴定

/为数据不明或参考文献中未明确提及；*为仅设计引物，并未实际开发验证，不计入开发引物数量统计

/ means that the data are unknown or not explicitly mentioned in the reference； * means that the primers were only designed and not actually developed and validated，so they are not included in the count of developed primers

2 SSR分子标记在杜鹃花属植物中的应用

在研究杜鹃花属植物的过程中，许多研究人员使用了现有的SSR（表2），主要用于物种保护研究、杂交后代的真实性鉴定以及性状-标记关联分析等，为后续研究提供了宝贵的参考依据。

表2  利用现有SSR分子标记进行杜鹃花属植物研究统计
Table 2  Statistics on the use of existing SSR molecular markers for the study of Rhododendron

序号

No.

研究对象

Objectives

SSR引物

SSR primers

应用

Application

1 4个杜鹃花近缘种：毛杜鹃、西洋杜鹃、棕背杜鹃、羊踯躅［55］ 7对［48］ 通用性研究
2 高山杜鹃杂交种［56］ 5对［43，49］ 通用性研究、杂交后代真实性鉴定-推测亲本
3

8个杜鹃花属物种：露珠杜鹃、迷人杜鹃、窄叶杜鹃、羊踯躅、

杜鹃、云上杜鹃、碎米花、R. fuyuanesis［

57］

38对［17，43，46，49］ 通用性研究
4 喜马拉雅山脉东段杜鹃花属［58］ 18对［22］ 生物数据库信息开发标记、遗传多样性、通用性研究
5 兴安杜鹃［64］ 9对［31，56，59］ 保护策略、性状-标记关联分析
6 杜鹃花杂交子代［65-66］ 15对［20，22］、9对自主设计 杂交子代真实性鉴定
7 四明山6种野生杜鹃花：映山红、满山红、华顶杜鹃、云锦杜鹃、马银花和羊踯躅［67］ 6对［32］ 物种保护策略
8 红棕杜鹃［68］ 6对［44，46-47］ 物种保护策略
9 大树杜鹃［69］ 14对［44，46-47］ 物种保护策略
10 羊踯躅野生幼苗［70］ 20对［34］ 物种保护策略
11 R. metternichii var. Hondoense Nakai［71］ 6对［17］ 交配系统研究
12 R. metternichii var. Hondoense Nakai［72］ 8对（其中2对［17］） 交配系统（亲缘结构）
13 大白杜鹃［73］ 8对［46］ 交配系统研究
14 藏东南杜鹃花属植物［74］ 12对［33，37］ 基因交流研究
15 西南高原山地4种杜鹃花属植物：大王杜鹃、毛脉杜鹃、大树杜鹃和爆杖花［75］ 7对［46，47，57］ 基因交流研究
16 贵州百里杜鹃保护区杜鹃属主要野生种：马缨杜鹃、露珠杜鹃、大白杜鹃、皱叶杜鹃［76］ 20对［39，52］ 基因交流研究
17 常绿杜鹃［77］ 10对［43］ 杂交子代真实性鉴定（亲缘关系鉴定）
18 杜鹃的四个杂交种［78］ 23对［43，62，71，77］ 性状-标记关联分析
19 杜鹃花品种［79］ 6对［43］ DNA指纹图谱

2.1 杜鹃花属的物种保护研究

种群遗传结构维持了物种的遗传多样性和适应性，对于物种的长期生存和抵御环境压力至关重要。杜鹃花属起源于白垩纪［

80］，是杜鹃花科中最原始的属，杜鹃花属的系统发育反映了古地质和古气候的变迁［81］，为理解生物进化、地质剧变和气候变迁的研究提供参考。杜鹃花属分化剧烈，种类众多，往往生活在范围较小的生境中，容易受到环境变化和人类活动的影响导致灭绝，同时彼此之间存在频繁的杂交渐渗［82］可能会导致基因流的均质化，降低遗传多样性，因此需要对杜鹃花属植物进行种群遗传结构的研究。SSR标记能为杜鹃花属物种保护提供丰富的遗传信息，在确定物种的避难所及其迁移路线［83］、指导迁地保护、评估保护成效［84］等方面具有良好的应用前景。在全球变化（包括气候、人类活动干扰等）背景下，SSR标记能更好地为物种保护提供指导。目前已在R. metternichii var. Hondoense Nakai、欧洲杜鹃、大白杜鹃、大树杜鹃、翘首杜鹃、兴安杜鹃等几十种杜鹃花上开展了相关研究工作，主要分为3大类：杜鹃花保护策略研究、杜鹃花交配系统研究、杜鹃花基因流动研究。

运用SSR标记研究保护策略，主要通过遗传多样性和遗传结构分析，揭示遗传威胁因素等方面，确定遗传多样性较高的群体优先保护，并进一步提出就地或迁地等保护建议。吴富勤［

69］利用14个SSR标记分析了极小种群野生植物大树杜鹃的2个残存居群的遗传结构、遗传多样性和历史动态，提出保护建议。李盛辉［61］利用从受威胁物种翘首杜鹃中开发的10对引物对12个野生居群中的260个野生个体进行了遗传多样性及遗传结构的分析，提出了居群的综合保护策略。董丽敏等［70］利用SSR对羊踯躅野生幼苗进行遗传多样性和遗传结构研究，发现生境片段化已对羊踯躅的生存构成极大的威胁，并提出了具体保护措施。陈凯云等［32］从红马银花基因组上开发了8对SSR引物，对红马银花居群的遗传多样性进行分析，推测其濒危的主要原因是生境遭到破坏，遗传多样性暂时未受很大影响，建议以就地保护为主。李东宾等［67］利用6对红马银花EST-SSR引物［32］分析四明山6种野生杜鹃花的遗传多样性，建议对遗传多样性最低的珍稀濒危植物华顶杜鹃进行就地保护和迁地保育。张丽芹［68］利用6对SSR引物与5个DNA序列对红棕杜鹃8个居群进行遗传多样性、遗传结构和种群动态研究，提出维持生境从而防止过度的片段化是保障该物种应对全球变化适应性的关键。王丹［64］从13个兴安杜鹃居群得到9个多态性SSR位点，进行遗传多样性研究，提出了重点保护的种源和建议遗传多样性较高的群体优先进行就地保护。

利用SSR标记研究杜鹃花的交配系统，可分析繁殖模式对环境变化的适应，从繁殖生物学角度出发为濒危物种的保护提供参考。Naito等［

17］利用开发的7对引物分析了R. metternichii var. Hondoense Nakai的种群是由有性生殖和无性生殖共同维持的。Kameyama等［71］利用6对Naito等［17］开发的引物对18株开花的R. metternichii var. Hondoense Nakai的150 m×70 m样方内的花粉流动模式进行了研究，仅用6个微卫星位点就识别了95%的花粉供体，说明SSR标记可以提供关于自然群体中花粉介导的基因流的精确信息。Delmas等［29］利用从欧洲杜鹃开发的9对SSR引物来研究杜鹃花科物种的遗传结构，从而理解欧洲杜鹃的交配系统对荒地破碎化的进化响应。Wang等［73］利用之前开发的8个SSR位点分析了10个自然居群和4个采花居群的247个杜鹃个体的遗传多样性，结果表明当地居民采食大白杜鹃的行为没有导致其遗传变异的丢失。

通过SSR标记对杜鹃花属植物基因流进行研究，评估杜鹃花属杂交渐渗、近交、自交等现象，减少近交/远交衰退的风险，提出促进基因交流的保护策略。Kameyama等［

72］基于8个位点微卫星分析了日本广岛县一个区域内的174个R. metternichii var. hondoense个体间的亲缘关系，揭示了该种群可进一步分为3个亚群，并推测亚群内部和亚群之间不同的亲缘关系结构可能是由个体分布模式和种群密度不同导致的不同程度的基因流造成的。Zhang等［60］利用12个SSR分析了中国云南轿子山3种同域杜鹃花物种的遗传多样性和种群结构，确定了其特有的极少种群濒危植物毛脉杜鹃的杂交起源，为其物种保护提供新的思路。丁礼梅［75］利用前人开发的SSR对西南高原山地4种杜鹃花属植物大王杜鹃、毛脉杜鹃（极小种群野生植物）、大树杜鹃（濒危）和爆杖花（特有）进行了遗传多样性及小尺度空间遗传结构分析，发现它们均有较高的遗传多样性和一定的近交现象，并据此提出其源种群种子收集的最小距离，为种群回归遗传配置提供依据。李倩等［76］利用已发表的20对SSR引物对贵州百里杜鹃保护区杜鹃花属4个主要种包括马缨杜鹃、露珠杜鹃、大白杜鹃和皱叶杜鹃共120份材料进行遗传多样性分析，发现它们之间存在广泛的自然杂交渐渗。袁一波［74］利用12对SSR分子标记对18个野生种居群165份资源进行扩增，表明藏东南杜鹃花属植物整体遗传多样性较高，但大部分种间基因交流受到限制。

2.2 杂交后代真实性鉴定

杂交种的分子鉴定是判定杂交是否发生与杂交程度的关键，确定其遗传结构对杂交种的评估具有重要意义，而对物种杂交后代的真伪鉴定是杂交育种的重要环节［

85］。杜鹃花属种质资源丰富，遗传背景复杂，仅依靠形态学很难精确分辨，而分子标记能够在DNA水平上鉴定杂交后代，更加方便准确。利用SSR标记鉴定杂交后代真实性已在绣球［14］、月季［86］、非洲菊［12］等观赏植物中成功实践，在杜鹃花属上也有一定的应用。

利用SSR标记鉴定杂交后代的真实性，为筛选新种质提供依据。Scario等［

77］比较了AFLP、STMS、EST三种标记在常绿杜鹃遗传关系的鉴别能力，结果表明STMS、EST具更高的能力，但三者联合会更有效。Wang等［45］比较了DNA条形码与基于美容杜鹃开发的15对SSR标记的物种界定效果，表明SSR不仅能在基因组水平上区分所有物种群和每个物种中相对纯合的个体，还能在一些形态上不同的物种个体中揭示隐秘的内源杂交现象。苏鸣［65］、Su等［66］筛选出15对EST-SSR引物对3个杜鹃花杂交组合的88个杂交子代真实性进行批量鉴定，结果表明最少只需要2对引物就可以对所有杂交子代进行鉴定。沈梓力等［63］首次利用表型性状结合开发的10对SSR标记，检测F1群体49个个体及亲本的基因型，发现SSR标记的聚类与表型性状的聚类有一定的相关性但并不完全一致，并筛选出2个性状稳定且遗传优良的新种质。

利用SSR标记推测亲本，为杜鹃花属杂交育种的亲本选择提供参考。张露等［

56］综合利用筛选得到的10对SSR引物对69份不同高山杜鹃杂交种质资源的亲缘关系进行了评价，杂交种间的非加权配对算术平均（UPGMA，unweighted pair group method with arithmetic mean）聚类结果与其谱系分析结果基本一致，可对一些未知来源的育成品种资源进行祖先亲本类型的推测。

2.3 性状-标记关联分析

利用标记连锁图（LM， linkage mapping）和合适的分离群体进行连锁分析以及QTL定位是解析植物数量性状遗传基础的主要方法［

87］。在杜鹃花属中尚未单独利用SSR标记来构建遗传连锁图谱，通常与RAPD、AFLP等标记一起进行构建，主要关注的性状为表型性状，如花色、叶片长宽比、株高、地径、花径、分枝数、花量等，且图谱精度有限，还有很多重要性状如重瓣性、花香、抗性等未见报道。

Dunemann等［

62］利用种间杂交的分离群体开发了一张以RAPD标记为基础，辅以RFLPs和SSRs的第一张杜鹃花遗传连锁图谱，并对数量性状叶片褪绿和花色进行QTL分析。De Keyser等［78］在杜鹃（R.simsii Planch.）的4个杂交种的单独连锁图谱上建立了一个整合的框架图谱，以AFLP和SSR标记作为参考骨架，增加功能标记（EST和MYB）作为候选基因进行QTL分析。王丹［64］利用从兴安杜鹃上挖掘的3个SSR标记与表型性状（叶片长宽比、花色、株高、地径、花径、分枝数、花量）进行关联分析，获得与花色和叶片长宽比关联性较高的2个SSR位点，可为花色辅助育种提供新的标记参考。

3 总结与展望

虽然SSR标记在杜鹃花属植物的研究中取得了许多进展，但并非没有局限性。PCR扩增过程中的DNA聚合酶的滑脱（Replication slippage）产生滞后带（Stutter bands）［

88］，导致假阳性的SSR基因型比例过高，影响目标SSR基因型的准确鉴定［89］，优化PCR扩增条件可减少滞后带的影响［90］。多倍体或非整倍体植物种的应用还有待进一步验证［91］，多倍体植物的复杂基因结构易于出现假阳性，增加读带难度而误判，影响结果的准确性。此外，SSR每个位点的等位基因数量较多，可能会增大或抑制群体的群体间分化系数（Fst，fixation index）［92］。SSR使用位点数量相对较少，基因分型误差可能会导致较大的下游分析偏差［92］。无效等位基因会使等位基因被高估［88］，如在Zhang等［60］在研究中发现存在无效等位基因和样本数量不足的可能性。可通过筛选微卫星位点［88］，优化引物设计以提高特异性，以及通过增加重复测量，减少应用过程中可能产生的误差。

近年来，SSR分子标记在杜鹃花属中的应用研究日益增多，但由于公开发表的杜鹃花属基因组数据极为有限，只有10个物种，分别为灵宝杜鹃、白花杜鹃、杜鹃、朱红大杜鹃（R. griersonianum Balf. f. & Forrest）、红马银花、羊踯躅、马银花、欧洲杜鹃、R. kiyosumense（Makino）Makino、圆叶杜鹃（R. williamsianum Rehder & E. H. Wilson），只占整个杜鹃花属物种数量的0.8%，而杜鹃花植物组基因数据库（RPGD，the Rhododendron Plant Genome Database）［

93］也仅鉴定了马缨杜鹃、圆叶杜鹃、杜鹃3个物种的SSR并设计引物，但并未进行实际的开发应用，因此，利用SSR标记进行杜鹃花属植物的研究仍有很大空间，可重点围绕以下几个方面展开。

3.1 以濒危物种为重点大力开发属内SSR标记

根据《中国生物多样性红色名录———高等植物卷（2020）》［

94］，共收录杜鹃花属695种，其中受威胁（易危、濒危和极度濒危）的杜鹃花属植物有124种，包含极度濒危（CR，critically endangered）10种，濒危（EN，endangered）28种，易危（VU，vulnerable）86种。仅有14种利用SSR标记进行了遗传多样性研究，占受威胁物种的11.3%，占总数的2.01%，说明我国在杜鹃花属植物的物种保护研究方面仍有较大空白，很多物种保护现状不明。

濒危物种的遗传资源通常较为有限，种群数量稀少，开发濒危物种的SSR标记可以更精确地识别出濒危物种中的杂合位点，了解物种的遗传变异程度和基因流动情况，从而评估其适应环境和应对环境变化的能力。因此，大力开发杜鹃花属内SSR标记，尤其是濒危物种的SSR标记，在明确的遗传信息的指导下进行引种、迁地保护、回归等项目实践，对研究杜鹃花物种尤其是濒危物种的适应性和可持续性起积极作用，使物种保护工作更加精准有效。

3.2 重要性状关联辅助育种

SSR标记适用于遗传连锁图谱的构建、QTL定位、关联分析和分子标记辅助选择育种，在观赏植物上已有不少关键育种性状进行了QTL定位和关联分析，如蔷薇属［

95］对花瓣数、花期、花香、花色、花径、生长势、皮刺、株形和抗白粉病等多个农艺性状进行了QTL定位，但在杜鹃花属中仅有Dunemann等［62］和De Keyser等［78］构建了遗传连锁图谱进行QTL分析，进行性状关联的SSR标记较少，应用于分子辅助育种还有相当大的差距。因此，需要开发更多SSR标记，建立杜鹃花属高精度的遗传连锁图谱。

在性状选择方面，除观赏性状（花色、花形、重瓣性、开花习性、花香、花期等）外，也须对生物胁迫（如黑斑病、红蜘蛛、根腐病、叶斑病等）抗性、非生物胁迫（如低温、高温、干旱、盐碱等）抗性等展开研究，使杜鹃花属植物重要农艺性状相关基因的精细定位及基因编辑成为可能，积极推动分子辅助育种选育优良品种，实现科学研究与实际生产应用相结合。

3.3 构建DNA指纹图谱加强品种鉴定

杜鹃花属在长期的自然演化和种间杂交过程中形成了生态适应性各异、数量庞大的变异新异种或新无性系，同时我国杜鹃花品种名称存在大量的同物异名、同名异物及品种译名不当的现象，已有的鉴定主要通过农艺和形态表型性状进行，性状差异小，误差大，难以将种质材料完全区分开，分子手段可以弥补上述不足。DNA指纹图谱（DNA finger printing）是现在品种鉴定的主要手段之一，而SSR标记是目前最成熟的DNA指纹图谱建库技术［

96］，在其他植物上已有较多应用，如向日葵Helianthus annuus L.、芍药Paeonia lactiflora Pall［91］等观赏植物，西瓜Citrullus lanatus （Thunb.） Matsum. & Nakai、玉米等作物［91］，可借鉴其他物种SSR指纹库构建的成功经验，如核心位点组合法的建库思路、核心位点选择的指标等［96］，在杜鹃花属内进行应用。周泓［79］利用表型性状的数量分类和AFLP、SSR分子标记，构建了130个国内保存品种的指纹图谱，但SSR标记位点比较有限。今后需要扩大群体数量，利用更多的标记数量来承载尽量多的遗传信息，提高图谱的精准性和应用效率。高效精确的DNA指纹图谱将有助于杜鹃花新品种的审核和认定，为科学有效地保护植物品种知识产权、维护生产者和育种者的合法权益提供依据。

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