杨梅种质资源<bold>InDel</bold>标记开发及与熟期的关联分析

焦云; 高中山; 汪国云; 陈方永; 姚小映; 周超超; JIAO Yun; GAO Zhongshan; WANG Guoyun; CHEN Fangyong; YAO Xiaoying; ZHOU Chaochao

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杨梅种质资源InDel标记开发及与熟期的关联分析 PDF

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1. 宁波市特色园艺作物品质调控与抗性育种重点实验室，浙江宁波 315040； 2. 宁波市农业科学研究院林业研究所，浙江宁波 315040； 3. 浙江大学果树科学研究所，杭州 310058； 4. 余姚市农业技术推广服务总站，浙江余姚 315400； 5. 浙江省柑桔研究所，黄岩 318026； 6. 宁波市江北南珍水果专业合作社，浙江宁波 315037

最近更新：2025-03-07

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240626001

摘要

InDel标记已广泛用于果树分子标记辅助育种等研究领域，然而针对我国传统特色果树杨梅的相关研究报道甚少。本研究通过103份杨梅核心种质全基因组重测序及生物信息学分析，共获得了大小分布在1~50 bp 范围内的25831 个InDel。不同染色体上的InDel变异频率介于1/11297~1/8903；其中，CM025856.1染色体上发生InDel变异频率最高。通过注释分析发现有1312个InDel 分布在基因外显子区域，另有21055和6659个InDel分别分布在基因间区和内含子区域。经GO注释，上述InDel生物过程主要涉及细胞过程（Cellular process）和代谢过程（Metabolic process）；分子功能主要包括结合（Binding）和催化活性（Catalytic activity）。经KEGG 通路分析发现，InDel 所在的基因区域的功能主要为次生代谢、碳代谢和核质运输等。通过全基因组关联分析，获得20个与杨梅果实成熟期性状显著关联的InDel，其功能注释主要涉及线粒体、质体结构基因，三磷酸核苷水解酶和细胞分裂素信号蛋白等。进一步验证显示InDel EP-18标记对杨梅果实成熟期性状鉴定准确率较高，达89.25%；通过基因预测结果发现该位点注释为早期结瘤素家族（Early nodulin）基因。本研究筛选获得的InDel EP-18标记将为杨梅分子辅助育种提供重要的理论依据。

关键词

杨梅; InDel; 重测序; 关联分析; 成熟期

杨梅（Morella rubra，Sieb. et Zucc.）为杨梅科杨梅属常绿乔木，果实结构独特，富含花色素苷，是我国特产果树^［

1-3］，其中浙江省的栽培面积及产量均位居国内第一。当前杨梅主栽品种均为中晚熟品种，早熟和极晚熟品种匮乏，其成熟期集中于梅雨季节，造成市场饱和及商品果率低的产业瓶颈。利用分子标记辅助育种加快选育早熟和极晚熟杨梅优良品种，对提高当前杨梅生产经济效益具有极其重要的意义。InDel（Insertion/Deletion）标记根据不同个体基因组间同源序列发生的核苷酸片段插入或缺失开发而成，具有基因组内分布广、密度高、变异稳定、可重复性好及便于分型检测等优点，广泛应用于种质资源分析与分子辅助遗传育种、群体遗传分析等研究领域^{［参考文献 4-8}4-8］。杨梅遗传基础研究相对薄弱，本课题组前期研究主要集中于SSR分子标记开发及评价杨梅种质资源的遗传背景及群体结构组成^{［参考文献 9-12}9-12］，首次阐明了杨梅雌雄决定的遗传模式为雌性杂合型（ZW），并开发了高效的性别连锁分子标记用于育种筛选^{［参考文献 2

百度学术}2，13］。然而，杨梅果实重要经济性状高效遗传分子标记相关的报道较少。随着测序技术的发展以及杨梅参考基因组的公布，其InDel标记开发的成本和难度也随之降低。张淑文等^{［参考文献 14

百度学术}14］以10份杨梅种质资源为试验材料进行了果实性状统计及关联分析，鉴定获得24个InDel标记关联到22个性状和77个位点，主要为单果重、果形、可食率和硬度等性状指标，但是尚未涉及成熟期数量性状。近年来，本课题组已公布了杨梅第二代基因组^{［参考文献 2

百度学术}2］，这为后续挖掘杨梅基因组InDel标记以及基因资源挖掘提供了重要参考。在此基础上，本研究选用103份杨梅核心种质材料进行全基因组重测序，开发InDel标记并分析其功能注释；另外，将杨梅果实成熟期性状与重测序产生的InDel位点进行关联分析，筛选出与成熟期性状显著关联的InDel标记，并利用杨梅群体对其进行验证分析，以期为后续杨梅早熟品种的选育及相关分子育种研究提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

103份杨梅核心种质来自中国浙江69份、福建12份、湖南8份、广东5份、江苏4份、云南3份、贵州1份，美国1份，由宁波市农业科学研究院杨梅种质资源圃保存（表1）。

表 1 103份杨梅种质资源的来源信息和果实成熟期性状

Table 1 The passport information and fruit maturity traits of 103 Chinese bayberry germplasm accessions

名称 Name	成熟期 Mature stage	来源 Source	名称 Name	成熟期 Mature stage	来源 Source
台州梅2号 Taizhoumei No.2	晚	中国浙江台州	早梅-16 Zaomei-16	早	中国浙江温岭
NKY030	中	中国浙江宁波	蜡杨梅 Morella cerifera	晚	美国
纽叶梅 Niuyemei	中	中国湖南怀化	夏至红 Xiazhihong	中	中国浙江宁波
荸荠变1号 Biqibian No.1	早	中国浙江宁波	黑晶 Heijing	中	中国浙江温岭
YY12	晚	中国江苏苏州	台州梅1号 Taizhoumei No.1	晚	中国浙江台州
冬瓜梅 Dongguamei	中	中国湖南怀化	荸荠变3号 Biqibian No.3	中	中国浙江宁波
甬早梅2号 Yongzao No.2	早	中国浙江宁波	荸荠变4号 Biqibian No.4	中	中国浙江宁波
NKY083	中	中国浙江宁波	红尖花 Hongjianhua	中	中国浙江宁波
梅早变1号 Meizaobian No.1	中	中国浙江宁波	Y2012-52	中	中国浙江宁波
NKY010	中	中国浙江宁波	HC4	中	中国福建漳州
大黑炭 Daheitan	中	中国浙江温州	硬丝2号 Yingsi No.2	早	中国福建漳州
软丝 Ruansi	早	中国福建漳州	晚稻杨梅 Wandaoyangmei	晚	中国浙江舟山
广东大梅 Guangdongdamei	中	中国广东广州	NKY011	中	中国浙江宁波
三夹岙乌梅 Sanjiaaowumei	中	中国浙江宁波	YY37	晚	中国浙江宁波
早梅CX05 Zaomei CX05	早	中国浙江宁波	Y2012-83	中	中国浙江宁波
梅早变2号 Meizaobian No.2	早	中国浙江宁波	温岭本梅 Wenlingbenmei	中	中国浙江温岭
NKY004	中	中国浙江宁波	Y2012-82	中	中国浙江宁波
乌酥核 Wusuhe	中	中国广东广州	梅湖早 Meihuzao	早	中国浙江宁波
广东早梅 Guangdongzaomei	早	中国广东广州	白杨梅（大果） Baiyangmei （Big）	中	中国浙江绍兴
荸荠变2号 Biqibian No.2	中	中国浙江宁波	特早2号 Tezao No.2	早	中国云南红河
早大种 Zadazhong	早	中国浙江宁波	NKY009	中	中国浙江宁波
大果晚 Daguowan	晚	中国浙江宁波	大红袍 Dahongpao	中	中国浙江湖州
早荠蜜梅 Zaoqimimei	早	中国浙江宁波	春江杨梅1号 Chunjiangyangmei No.1	中	中国湖南怀化
白杨梅（小果） Baiyangmei （small）	中	中国浙江绍兴	白杨梅6号 Baiyangmei No.6	中	中国浙江绍兴
陈早变1号 Chenzaobian No.1	早	中国浙江宁波	荸荠变5号 Biqibian No.5	中	中国浙江宁波
NKY094	中	中国浙江宁波	陈早变2号 Chenzaobian No.2	早	中国云南红河
隔山 Geshan	中	中国福建漳州	白杨梅7号 Baiyangmei No.7	中	中国浙江绍兴
广东大黑 Guangdongdahei	晚	中国广东广州	陈公早梅 Chengongzaomei	早	中国浙江宁波
风欢 Fenghuan	晚	中国浙江宁波	HC1	中	中国福建漳州
白杨梅2号 Baiyangmei No.2	中	中国浙江宁波	春江杨梅2号 Chunjiangyangmei No.2	中	中国湖南怀化
安海片早生 Anhaipianzaosheng	早	中国福建漳州	早小种 Zaoxiaozhong	早	中国浙江宁波
Y2012-47	中	中国浙江宁波	月粒盘 Yuelipan	中	中国浙江宁波
YY03	晚	中国浙江宁波	乌西梅 Wuximei	中	中国广东广州
早佳 Zaojia	早	中国浙江兰溪	丁岙 Dingao	早	中国浙江温州
松浆梅 Songjiangmei	中	中国浙江宁波	水晶 Shuijing	中	中国浙江绍兴
YY20	中	中国浙江宁波	特早1号 Tezao No.1	早	中国福建漳州
木洞 Mudong	中	中国湖南怀化	白东魁 Baidongkui	中	中国福建漳州
余姚早 Yuyaozao	早	中国浙江宁波	HC2	中	中国福建漳州
晚荠蜜梅 Wanqimimei	中	中国浙江宁波	余姚早大 Yuyaozaoda	早	中国浙江宁波
大果红 Daguohong	中	中国浙江宁波	太波梅 Taibomei	中	中国湖南怀化
花岙白梅 Huaaobaimei	中	中国贵州贵阳	温岭早梅 Wenlingzaomei	早	中国浙江温岭
早水晶 Zaoshuijing	早	中国浙江绍兴	银红梅 Yinhongmei	中	中国湖南怀化
东魁 Dongkui	晚	中国浙江台州	黑大 Heida	中	中国浙江宁波
普早2号 Puzao No.2	早	中国福建漳州	迟色 Chise	中	中国浙江杭州
HC3	中	中国福建漳州	KYZ1	早	中国浙江宁波
大叶细蒂 Dayexidi	中	中国江苏苏州	小叶细蒂 Xiaoyexidi	中	中国江苏苏州
大叶梅 Dayemei	中	中国湖南怀化	东魁变1号Dongkuibian No.1	晚	中国浙江台州
YY42	中	中国浙江宁波	东魁变2号 Dongkuibian No.2	晚	中国浙江台州
大叶光 Dayeguang	早	中国江苏苏州	台州本梅 Taizhoubenmei	中	中国浙江台州
王子安海 Wangzianhai	早	中国福建漳州	白杨梅 Baiyangmei	中	中国浙江绍兴
瑞旭 Ruixu	晚	中国浙江宁波	YYZ	早	中国浙江宁波
普早1号 Puzao No.1	早	中国云南红河

1.2 全基因组重测序

杨梅核心种质资源圃种植株行距为4 m×6 m，树龄10年生，于2021年随机适量选取每份材料春梢顶端嫩叶，使用柱式植物基因组DNA抽提试剂盒（EZ-10 Spin Column Plant Genomic DNA Purification Kit，上海生工生物工程股份有限公司）提取杨梅叶片基因组DNA，具体操作步骤参照其说明书。利用凝胶成像系统Bio Doc Analyze （BDA） Digita （Analytik Jena AG， Jena， Germany）和Nanodrop 2000（Thermo Scientific，San Jose，CA，USA）分光光度计检测DNA的完整性和纯度，并确保每份样品DNA终浓度高于50 ng/μL，总量大于2 μg，置于-80 ℃保存备用。

将103份杨梅核心种质DNA交由上海生工生物工程股份有限公司完成建库及重测序：2 μg DNA样品用Covaris S220 （Covaris， Massachusetts， USA）随机打断成长度为400 bp的片段^［

15］，使用TruSeq Library Construction Kit（Illumina，San Diego，CA）并参照其说明书进行建库，DNA片段经末端修复、加ployA尾以及测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成测序文库制备^{［参考文献 16

百度学术}16］。随后在Novaseq 6000平台上进行PE150双末端测序，每个样品测序深度大于25×，原始测序数据过滤利用Q30标准对序列质量进行评估及过滤获得Clean reads。

1.3 InDel位点挖掘与统计

基于杨梅参考基因组序列Mru_ZJU_2（Bio Project：PRJNA398601，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA398601/），使用BWA^［

17］对过滤后的Clean reads数据进行比对。通过SAMTOOLS 软件^{［参考文献 18

百度学术}18］去重复；采用GATK3.8 软件的UnifiedGenotyper 模块进行Indel的检测，使用VariantFiltration 进行过滤接、局部比对和碱基质量值校正等处理，获得可靠的InDel位点^{［参考文献 19

百度学术}19］。利用SnpEff 4.3软件统计分析基因组中InDel位点数量、变异频率、分布位置等^{［参考文献 20

百度学术}20］。

1.4 InDel 注释及功能分析

参照拟南芥基因组注释信息（TAIR10，http：//www.arabidopsis.org），并利用CLC Genomics Workbench 12.0软件中的BLAST组件建立杨梅全基因组的GO注释文件（E值为1e-5）^［

21］。通过已知InDel位点的基因组起始位置信息提取相应的基因编号，并利用OmicShare在线分析云平台（https：//www.omicshare.com/tools/）进行GO和KEGG分析。

1.5 成熟期性状关联位点的获得与筛选

首先使用CLC Genomics Workbench 12.0软件过滤低频率InDel位点，将群体样本中InDel出现频率阈值设置为5 %（即剔除群体中样本数量低于5 %的InDel位点）。其次，依据NY/T 2761-2015《植物新品种特异性一致性和稳定性测试指南—杨梅》^［

22］进行果实成熟期评价与记录，从中随机选择不同成熟期杨梅品种并划分为两个差异组，即早熟和中晚熟组（对照），每组含3个品种的重测序结果。基于上述软件Variants Comparison模块并经过费希尔精确检验（P≤0.05）筛查两组群体中显著关联的InDel位点。为便于后续分子辅助育种标记开发，进一步剔除由简单重复序列构成的InDel位点，然后筛选出6~50 bp长度范围内的纯合型InDel位点，并优先考虑基因组上序列长度较长且连续性位置的InDel位点用于后续引物设计。

1.6 引物设计及验证InDel标记准确率

基于上述InDel位点，参照扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR， amplification refractory mutation system PCR）的引物设计原理^［

23］，在反向引物的3′端引入一个错配碱基后进行特异性引物设计，委托生工生物工程上海股份有限公司合成相关引物。采用ABI Q6 Flex实时荧光定量PCR系统平台中的Genotyping功能模块分析验证InDel标记准确率。PCR反应体系如下：20 ng/μL的样品基因组DNA 2.0 μL，2×SG Fast qPCR Master Mix 5 μL，10 μmol/L的正反向引物各0.5 μL，ddH₂O补足至10 μL。PCR扩增为两步法程序，即预变性和循环扩增，具体为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，30个循环。最后将上述PCR反应的分型检测结果与表型进行核对，以确定分子标记的检测准确率。

2 结果与分析

2.1 杨梅基因组重测序与InDel分布

本研究共采集了103份杨梅核心种质嫩叶，经过全基因组测序总共产生了约751 G测序原始数据。经过质控及Q30标准过滤后的Clean reads占93.07%。GC含量平均值为40.22%。经鉴定后获得所有基因组InDel位点信息，共计30244个，包括17006个插入变异和13238个缺失变异；总体上InDel出现频率为10234 bp/个；筛选出长度为1~50 bp的InDel位点共计25831个，以小片段（6～10 bp）分布为主（图1）。随着InDel 碱基数增加，Indel 数量呈现出明显减少趋势。其次，在不同染色体上的InDel分布比较均匀，其数量在3078~3723个之间，不同染色体的InDel出现频率介于1/11297~1/8903；其中，CM025856.1染色体上InDel出现频率最高，即8903 bp会出现1个InDel（图2）。

图1 不同长度InDel在杨梅基因组上的分布情况

Fig. 1 The distribution of different size InDel in Chinese bayberry genome

图2 杨梅染色体上InDel的数量与分布频率

Fig. 2 The number of InDel and distributed frequency on each chromosome in Chinese bayberry

2.2 GO 注释及KEGG 通路分析

基于杨梅全基因组序列注释信息，通过相关软件获得所有InDel的位置信息。其中，分布在外显子区域的InDel有1312个，远低于内含子区域分布数量（6659个）。5′和3′端非翻译区域内有分别有724个和436个InDel。基因上游和下游1 kb范围内区域分别有2507个和2173个InDel。其次，仅有152个InDel 存在于剪接位点区域（表2）。

表2 杨梅基因组InDel区域的功能分类概况

Table 2 The functional classification of InDel in Chinese bayberry

类型 Type	总数Totality	比例（%）Percent
内含子区域Intron region	6659	18.96
外显子区域Exon region	1312	3.74
基因间区Intergenic region	21055	59.95
剪接位点受体Splice_site_acceptor	27	0.08
剪接位点供体Splice_site_donor	27	0.08
剪接位点区域Splice_site_region	152	0.43
基因上游1 kb区域Gene upstream 1 kb region	2507	7.14
基因下游1 kb区域Gene downstream 1 kb region	2173	6.19
3′端非翻译区域 3′untranslated regions	436	1.24
5′端非翻译区域 5′untranslated regions	724	2.06

此外，对InDel所在DNA区域序列片段进行GO功能注释分析，结果表明生物过程（Biological process）中占比例最多的是细胞过程（Cellular process），包含有3186个含InDel的基因区域；代谢过程（Metabolic process）则次之，包含有2604个InDel（图3A）。在分子功能（Molecular function）类目中，蛋白结合（Binding）最高，包含2906个InDels，催化活性（Catalytic activity）次之，包含2100个InDels。在细胞组分（Cellular component）中仅包含两类功能，即细胞结构组件（Cellular anatomical entity）及含蛋白质的复合物（Protein-containing complex），分别含有3812个和756个InDels。对InDels序列进行KEGG注释分析，结果显著富集到24个基因通路信息（P≤0.05）。其中，TOP20通路中大部分与各类代谢通路相关（图3B），最多的是次生代谢物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites），其次是碳代谢（Carbon metabolism）和核质运输（Nucleocytoplasmic transport）。

（图3）

A：InDel的GO注释结果；B：InDel的KEGG分析

A： GO annotation of InDel； B： KEGG pathway analysis of InDel

图3 杨梅基因组InDel位点基因功能注释分析

Fig. 3 Functional annotation analysis of InDel locus gene in Chinese bayberry genome

2.3 InDel与成熟期性状的关联分析

通过对成熟期极端差异群体的全基因组关联分析，共计发现118个显著性（P≤0.05）InDel位点，优选其中非重复序列结构组成的位点进行引物设计，获得InDel EP-1~InDel EP-20共计20个InDel标记组合，其PCR扩增长度范围为84~120 bp（表3），主要来源于CM025849.1、CM025855.1和CM025856.1染色体。其次，根据InDel标记物理位置，预测了相关基因的功能信息，与线粒体、质体结构基因关联的InDel EP-1、InDel EP-19、InDel EP-20和InDel EP-13等；InDel EP-2关联的位点是三磷酸核苷水解酶（Nucleoside triphosphate hydrolase）结构基因；与InDel EP-18关联的位点是早期结瘤素家族基因Early nodulin-93-like；与InDel EP-14关联的基因位点是AT5G61680.1，然而其具体功能尚不清楚；与InDel EP-15关联的基因位点是细胞分裂素信号蛋白家族基因ARR14-like；与InDel EP-17关联的基因位点是欧洲葡萄抗霜霉病家族基因Disease resistance protein RPV1。

表3 杨梅果实成熟期显著性关联的InDel及注释信息

Table 3 The InDel and annotation information of the significant association of ripening traits in Chinese bayberry fruits

名称 Name	序列（5′-3′） Sequence （5′-3′）	长度（bp） Lengh	InDel 位置 Position	功能注释 Functional annotation
InDel EP-1	F：CGTACACGCAGTGCAGTTGTCAGTTATC R：GACTACCACGTATACGGGAGGAGTACCTGGTTT	104	CM025855.1：31401090	线粒体结构基因
InDel EP-2	F：GAGCTTTTAGTCCACTGGCAGCGGCAAAC R：GAATTAGAACACCTTGCTCGCAAGGTGAGG	108	CM025855.1：19247811	三磷酸核苷水解酶结构基因
InDel EP-3	F：GAGCTTTTAGTCCACTGGCAGCGGCAAAC R：GTCTGGACTTGCAAGGCTCGTCAAGTCTCTG	86	CM025855.1：30530049	磷酸丙糖异构酶基因
InDel EP-4	F：GTAGCTTGGACTCCTAAAGTGACACGGT R：GCGGATGATAGAGTGTCTAAGATATGTACTC	116	CM025855.1：34429328	RING结构域蛋白质170
InDel EP-5	F：TGGGACACATACTCATCTTTAACTCG R：CTATGGGGCAAGGGAGTTTTCAAAACT	81	CM025855.1：18454904	核苷酸转移酶
InDel EP-6	F：GACCGGAGGAGTTATAATTCACTACCCT R：GACATTGTGTGTTTGATTTAGATGGAGCTTAAAC	120	CM025855.1：33525190	植物钙调素依赖性蛋白合成酶
InDel EP-7	F：AAGATGTACTCGACATCTTACTGTGAAAT R：CGGCAGCCAGGTATACTCTCCAACAGGGA	100	CM025856.1：13735052	芳香酸脱氢酶2
InDel EP-8	F：GTGGTTCAGTGCCATGAACTTGATATAAAATG R：CCACGTCATTGACACTGTCTGCGCTTGTTTG	101	CM025856.1：27376500	核仁因子1
InDel EP-9	F：CGTGGTACAGGTATGGTGTTGGGATCTCTCG R：GCCTCATTTCCTCATTGCCGACGCACTTTTGAC	96	CM025856.1：8373043	小泛素样修饰蛋白激活酶1B
InDel EP-10	F：AAAAAATTTACTACTTAACTTATGTC R：CGAATAGATTCATCTAGTTTTAAATCTCTG	107	CM025856.1：2670173	Degradation periplasmic_proteins_15
InDel EP-11	F：TCCACCAGTCGACTTCATCCCCTGCATG R：CGTGAAGTGGTGTTAATGGCGACCGATTC	86	CM025856.1：20600810	Low PSII accumulation 2
InDel EP-12	F：TCTCATGATAAGTAGATCTCATTTTTG R：CGAGCTCTTAGAGAACAGTGTTGTAACCAACA	92	CM025856.1：8045075	糖基转移酶家族基因
InDel EP-13	F：GGTTCCCATTACTATCTCCGAGGTGTCTC R：CACACTGTCTCCAGAGAGAACCGATTTCAT	95	CM025856.1：17276262	质体结构基因
InDel EP-14	F：GTATTTGTTTCCAATGATCGAATGGTATGTATTG R：GCGTTACTGAAACAATCGATCGTCTA	108	CM025856.1：14509789	未知功能的基因 AT5G61680.1
InDel EP-15	F：CGGTTTTAAGGTTTTGCAGATAGTAGGC R：ATATTTATATAGGTGCCAAGCAAATAGATGTGA	108	CM025856.1：26896700	细胞分裂素信号蛋白家族基因 ARR14-like
InDel EP-16	F：AGAATTATCAAGTCAATAATTGCGCGACT R：CGAAATCTTTAATCCAAACTTACTCGTAGA	106	CM025852.1：3230972	WD重复膜蛋白61
InDel EP-17	F：CCAAAAACCATTTAGCTGGAATATACACTG R：CTTTAGGTGCACAAAGGACTAAGGGTAGC	113	CM025849.1：30724568	欧洲葡萄抗霜霉病家族基因 RPV1
InDel EP-18	F：GCCACCTACACCTACACGTTAAGGGCAAAAACTA R：GAGTCCAATATGAATGCAAGTTAACCAAG	84	CM025849.1：30722625	早期结瘤素家族基因 Early nodulin-93-like
InDel EP-19	F：TGAAGAATTTAAGGTGGTTCAGTCAAG R：TCTAAGGAATGTGGTTCCTATGTGATTTG	105	CM025849.1：30721660	线粒体结构基因 AtMg00810
InDel EP-20	F：GAGAAACAAAGCTACGACACAACAGATTG R：GCTGTTCTTGTGCTGCCAACCTACAAGTC	96	CM025849.1：30721838	线粒体结构基因 AtMg00810

2.4 成熟期InDel标记的分型结果验证

用表3中InDel标记对由随机选择93份杨梅种质组成的自然群体进行分型验证，以筛选可用于杨梅果实成熟期早期鉴定的育种标记。基于田间成熟期调查结果，仅发现InDel EP-18的杨梅果实成熟期鉴定准确率较高，达89.25 %（图4），可将杨梅种质清晰地划分为两个簇（A簇和B簇），分别代表早熟与中晚熟种质群体；因此，InDel EP-18标记可适用于杨梅果实成熟期的快速鉴定。而其他InDel标记分型结果与果实成熟期没有发现明显的关联规律。

图4 基于qRT-PCR扩增平台的InDel EP-18标记分型结果

Fig. 4 The results of InDel EP-18 labeling based on qRT-PCR amplification platform

×：未检测到扩增产物；不同的等位基因类别用不同颜色加以区分，A簇为早熟杨梅种质群体（蓝色），B簇为中晚熟杨梅种质群体（绿色）；红色圆圈代表不同的簇

×：No amplification products were detected； Different allelic classes are distinguished by different colors，cluster A was the early arbutus germplasm population （blue），cluster B was the middle and late maturing Chinese bayberry germplasm population （green）；The red circles represent different clusters

对InDel EP-18位点部分DNA序列进行比对分析（图5），以确定不同成熟期品种基因型差异类型。结果表明，与早熟品种相比，中晚熟品种基因型存在长度有11 bp的缺失位点；同时，中晚熟品种序列中第67 bp、111 bp和115 bp存在SNP位点，对应的碱基为C、A和C，早熟品种序列的上述位点对应的碱基替换为T、G和T，突变位点均在其编码序列区域，且均为非同义突变。根据基因注释，该基因为早期结瘤素家族（Early nodulin）基因，参与植物根瘤的形成、开花、花粉管与柱头的识别及生殖发育等多种生物学过程^［

24-25］。

图5 不同成熟期杨梅种质InDel EP-18位点部分DNA序列比对

Fig. 5 Alignment of partial DNA sequences at InDel EP-18 sites on Chinese bayberry germplasm at different maturity stages

早熟品种为‘早大种’重测序结果；中晚熟品种为‘荸荠种’和‘瑞旭’重测序结果；不同的碱基以不同颜色标识；保守度以柱状图展示，越高意味着碱基越保守，反之则越不保守

The precocious variety was “Zaodazhong” resequencing results； The middle and late maturing varieties were ‘Biqizhong’ and ‘Ruixu’； Different bases are identified by different colors； The degree of conservation is shown in a bar chart， with higher values indicating more conservative bases， less conservative bases， conversely

3 讨论

InDel标记在基因组内分布的丰富性仅次于SNP，且远高于SSR；基于PCR技术进行InDel标记分型评价，其检测难度相较于SNP更为简单便捷，具有准确性高、稳定性强等特点^［

26-28］。本研究通过103份杨梅种质重测序数据与参考基因组比对及质控，共计获得了30244个InDel位点。与其相比，陈正杰等^{［参考文献 29

百度学术}29］选取18份大豆种质资源进行全基因组重测序分析共获得201384个InDel位点，远高于本研究中杨梅基因组的InDel 位点；同时，高于橄榄果实转录组中的18548个InDel位点^{［参考文献 30

百度学术}30］。由此可见，不同植物中InDel的位点数量存在较大差异，这可能是由物种遗传背景、采样群体大小以及InDel过滤阈值等原因造成的。与前期相关研究报道类似，杨梅InDel位点主要分布于基因间区及内含子区域，仅有3.74 %的InDel位于外显子区域，低于茄子（4.1 %）^{［参考文献 31

百度学术}31］。同时，桑葚转录组序列中InDel片段的长度以1~3 bp为主，而长度超过10 bp 的缺失突变数量远大于插入突变数量。与桑葚不同的是，本研究中杨梅InDel片段的长度主要为6~10 bp，并且插入类型的InDel位点数量大于缺失类型，此结果与花生类似^{［参考文献 4

百度学术}4］。因此，不同的植物种类其InDel位点类型比例差异亦是明显的，究其原因目前还不清楚。

另外，InDel可能会导致蛋白质结构和功能的改变，从而影响生物体的性状^［

32-33］。为明确InDel突变可能引起的基因功能变化，本研究将鉴定获得的InDel进行GO和KEGG功能注释分析。分析结果与相关研究有一定差异，杨梅基因组的InDel在分子功能中蛋白结合类别的InDel的数量最多，催化活性次之，而花生简化基因组测序InDel位点GO注释分析结果恰与其相反^{［参考文献 4

百度学术}4］。上述蛋白结合和催化活性两类功能在植物生长发育、响应胁迫转录组测序分析结果中均有类似的体现，其所含的差异表达基因数量通常也多于其他分类^{［参考文献 34-38}34-38］。这表明基因组中丰富的InDel位点可能是构成基因转录水平差异变化的重要来源，两者之间的调控关系错综复杂，尚需后续大量实践进行探索及验证。此外，KEGG注释分析结果TOP20通路中最多的是次生代谢物的生物合成，其次是碳代谢，这与花生中的InDel位点研究结果一致^{［参考文献 4

百度学术}4］；类似地，吴磊等^{［参考文献 39

百度学术}39］发现拟斯卑尔脱山羊草InDel位点也主要涉及到蛋白质结合、催化以及次生代谢等过程，这些InDel主要相关的基因功能是植物体内重要性状形成的基础。植物中次生代谢物通常具有特殊生物活性及功能，不仅能够帮助其适应特殊环境、抵御病虫害，而且对农业、医药和工业生产均具有极其重要的价值，为人类提供了丰富的药物，香料及工业原料^{［参考文献 40-43}40-43］。因此，解析植物InDel位点与次生代谢物的生物合成途径以及遗传机制对于改良重要经济性状和植物次生代谢物产业化应用至关重要。

一般认为果实成熟期属于复杂的数量性状，受到多个位点协同调控^［

44］。本研究中，杨梅果实成熟期与重测序获得的InDel位点进行关联分析获得的InDel EP-18对杨梅果实成熟期的鉴定准确率为89.25%，并未达到100%。因此认为杨梅果实成熟期也可能由多个基因控制，而非仅受单一基因位点制约。目前，果树领域关于果实成熟期的分子标记开发相关研究取得了一些进展。例如葡萄叶酸转运蛋白基因VvFBT编码区域鉴定出多个SNPs与早熟系谱群体具有极显著关联性（P<0.0001），其在葡萄浆果发育过程中特异性高表达，该基因为早熟葡萄品种的分子标记辅助育种提供了重要参考^{［参考文献 45

百度学术}45］。Branchereau等^{［参考文献 46

百度学术}46］将甜樱桃早花期QTL定位于第4连锁群，并转化4个高度关联开花时间的KASP标记用于辅助育种。然而，本研究中并未发现与上述基因相关的InDel位点。可见，果实成熟期的调控机理错综复杂，不同物种的成熟期基因关联位点差异较大。本研究结果获得的早熟性状显著性关联位点InDel EP-18注释为早期结瘤素家族基因Early nodulin-93-like，其可能在杨梅果实早熟性状调控过程中发挥重要作用。相关研究表明，拟南芥Early nodulin MtN21家族基因突变体在长日照条件下开花时间提早于野生型^{［参考文献 25

百度学术}25］；同时，Early nodulin是一个多功能基因家族，参与根瘤的形成、开花、花粉管与柱头的识别及生殖发育等多种生物学过程^{［参考文献 24

百度学术}24］。杨梅（属于壳斗目）是极少数分布在热带、亚热带的放线菌结瘤果树之一^{［参考文献 47

百度学术}47］，根部能与放线菌共生产生根瘤从而发挥固氮作用。然而，杨梅早熟性状关联位点注释结果中存在的早期结瘤素家族基因Early nodulin-93-like是否参与到杨梅果实成熟期调控途径还有待进一步验证。

综上所述，当前基因组InDel相关研究主要集中在变异特征分析及种质资源的遗传多样性分子标记开发方面^［

48-50］，而对其功能倾向性研究和验证分析还存在较大不足。本研究基于杨梅重测序数据鉴定全基因组的InDel位点特征并进行功能预测，探索其与重要经济性状之间的联系，为后续核心种质分子鉴定及重要性状的基因定位等工作奠定前期基础。InDel EP-18所涉及的Early nodulin-93-like基因具体功能验证将作为下一步研究重点，以确认其在杨梅功能基因中的作用，为杨梅种质资源研究及遗传改良提供重要参考。

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