<bold>OsELF3-1</bold>与<bold>OsARID3</bold>互作调控水稻根部性状

孙琪; 芦佳浩; 陈昊; 王潇澈; 于之雯; 赵辰妃; 徐铨; 马殿荣; SUN Qi; LU Jiahao; CHEN Hao; WANG Xiaoche; YU Zhiwen; ZHAO Chenfei; XU Quan; MA Dianrong

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OsELF3-1与OsARID3互作调控水稻根部性状 PDF

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1. 沈阳农业大学水稻研究所，沈阳 110866； 2. 辽宁省水稻研究所，沈阳 110101

最近更新：2025-04-03

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240628001

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摘要

根系是水稻植株的重要组成部分，在植物固定、水分和营养物质获取等生长发育过程中起重要作用。本研究发现oself3-1突变体的根系显著变短，将突变体与野生型笹锦杂交构建F₂分离群体进行遗传分析，表明突变性状由一个隐性单基因调控。通过图位克隆将OsELF3-1定位在6号染色体一段50.9 kb的区间内，该区间内共有4个开放阅读框（ORF），通过序列比对发现突变体仅在ORF4（OsELF3-1）的第二个外显子上缺失7个碱基，导致基因发生移码并提前终止，推测OsELF3-1为目标基因。OsELF3-1的CRISPR/Cas9敲除突变体的根系显著短于野生型笹锦，验证OsELF3-1参与根系长度调控。为进一步阐明OsELF3-1的调控网络，利用酵母双杂交筛选到OsELF3-1的互作蛋白OsARID3，OsARID3具有ARID功能结构域（ARID3 DNA binding domain）、α-晶体蛋白/热休克蛋白20结构域（α-crystallin/Hsp_domain）及热休克蛋白20（HsP20）等结构域，以及依靠钾离子的钠离子/钙离子交换的结构域（K⁺-dependent and Na+/Ca+ exchange domain）。调查OsARID3-RNAi突变体发现其根系显著短于野生型笹锦，说明OsARID3可能参与根系长度调控。通过3 K测序数据分析发现OsARID3自然变异共有15个单倍型，且存在明显的籼稻、粳稻分化，粳稻主要属于单倍型I、IV和VI。综上所述，本研究发现OsELF3-1与OsARID3互作调控水稻根系，为进一步深入解析水稻根系生长发育调控网络提供理论基础和种质资源。

关键词

水稻; 根系; OsELF3-1; OsARID3; 图位克隆

水稻是重要的粮食作物，为我国超过半数的人口提供主食。近年来耕地面积减少，温室气体排放增加，全球气温升高，气候灾害频发，增加了绿色农业可持续发展和保障粮食安全的难度。因此提高水稻单产以满足逐年增长的人口粮食需求，对维护国家粮食安全战略具有重要的意义^［

1-2］。水稻根系是吸收水分、营养及激素合成的重要器官，影响水稻生长。因此强壮的根系是水稻生产力的关键，也是分子生物学研究和育种的重要目标性状^{［参考文献 3-4}3-4］。

水稻根系是由主根、不定根、侧根和根毛组成的须根系，在正常条件下水稻根长、根数和根体积在各生育期均与产量呈极显著正相关^［

5］。近年来的分子生物学研究成功克隆了多个根系发育调控基因，其中大多数和水稻的抗性及产量相关^{［参考文献 6-8}6-8］。在这些水稻根系性状调控基因克隆的研究进展中，根长相关基因受到较多的关注，其中GLR3.1基因编码类谷氨酸受体蛋白，对水稻幼苗早期根尖分生组织维持细胞分裂和细胞存活不可或缺，glr3.1突变体的初生根、不定根和侧根都变短，初生根顶端直径变小，组织学和DNA合成分析表明突变体根的分生组织活性丧失，伴随着细胞程序性死亡的提高，苗期后的营养生长期和生殖生长期长出的根则与野生型差别不大^{［参考文献 9

百度学术}9］。水稻中另一个与根长相关的重要基因是深根基因DRO1，其受到生长素负向调控，并且影响根尖部位的细胞伸长，从而导致根系的不对称生长和对重力相应的向下弯曲。DRO1高表达可以增加根生长角度，使其生长方向更为竖直。提高DRO1表达量能够改变根系形态，从而提高水稻避旱能力^{［参考文献 10-11}10-11］。此外硝酸盐转运蛋白伴侣蛋白OsNAR2.1能与OsNRT2.1/2.2和OsNRT2.3a互作，调控不定根长度^{［参考文献 12-13}12-13］。

水稻OsELF3基因家族与拟南芥AtELF3家族同源，水稻基因组中存在两个OsELF3家族基因，分别为OsELF3-1/Hd17/Ef7及OsELF3-2。前人已经对基因OsELF3-1进行了克隆，其在水稻昼夜节律和光周期途径开花方面发挥重要功能。OsELF3-1通过正调控OsLHY的表达进而影响水稻昼夜节律，通过激活Ehd1和抑制Ghd7在长短日照条件下均促进水稻开花^［

14-15］。OsELF3-1可以与OsLUX、OsELF4s形成水稻三元抑制蛋白复合物，在耐盐性方面发挥作用^{［参考文献 16

百度学术}16］。OsELF3-2负调控水稻对稻瘟病菌的免疫反应，其突变体oself3-2比野生型中花11更抗稻瘟病^{［参考文献 17

百度学术}17］。最新研究发现泛素连接酶IPI1通过影响E3泛素连接酶的活性进而直接或间接地影响OsELF3-1和OsELF3-2的稳定性，进而协同调控水稻的开花和抗病^{［参考文献 18-19}18-19］。虽然水稻中两个OsELF3基因已经被成功克隆，在抽穗期和稻瘟病抗性上的分子调控网络也逐渐清晰，但是在根系生长调控上的功能仍需进一步研究。本研究采用图位克隆鉴定到一个调控水稻根系长度的目标基因OsELF3-1，利用CRSIPR/Cas9对OsELF3-1的功能进行验证，通过酵母双杂交筛选到OsELF3-1与OsARID3互作，使用RNAi技术构建OsARID3-RNAi转基因植株验证了OsARID3参与调控水稻根系生长，本研究为解析水稻根系生长基因调控网络提供理论基础和种质资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从实验室的笹锦EMS诱变突变体库筛选得到根系变短的oself3-1突变体。试验以笹锦为野生型材料，再利用CRISPR/Cas9载体构建新的oself3-1突变体，RNA干扰技术构建OsARID3-RNAi株系，oself3-1突变体与野生型杂交获得的F₁及F₂群体（124株），突变体与丰锦杂交构建包含1344个植株的F₂群体用于突变基因精细定位。野生型笹锦、oself3-1突变体、oself3-1突变体与野生型笹锦杂交获得的F₁材料、OsARID3-RNAi株系均于2022年种植于沈阳农业大学水稻所研究基地，行长5 m，行距30 cm，株距13.5 cm，其中野生型笹锦、oself3-1突变体和OsARID3-RNAi株系均种植5行，3次重复，栽培方式均与大田生产相同，小区纯氮施用量为150 kg/hm²，施肥比例为基肥∶分蘖肥∶穗肥 = 5∶3∶2，磷肥75 kg/hm²全部基施；钾肥75 kg/hm²，施肥比例为基肥∶穗肥 = 8∶2，基肥均于播前整地时施入。在野生型笹锦、oself3-1突变体及OsARID3-RNAi株系的拔节期与齐穗期各取6株进行取样鉴定基因表达量。

1.2 目标基因的图位克隆及区间内候选基因分析

利用突变体oself3-1与野生型笹锦杂交得到F₁植株，F₁植株自交得到包含124个植株的F₂群体。水培条件下在培养箱内（14 h光照30℃/ 10 h黑暗22℃）播种4 d后，将突变体、野生型笹锦、F₁植株和F₂群体根系摆放在盛有一薄层水的透明塑料器皿（30 cm×30 cm）中，用扫描仪（Epson Expression 1680 Scanner）进行图像扫描，再用根系分析系统（WinRHIZO）进行分析，计算根长，分析突变体根系长度差异性状是否受单隐性核基因控制。另将突变体与丰锦杂交构建包含1344个植株的F₂群体进行突变基因精细定位，明确目的基因的定位区间。利用水稻基因组注释数据库（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）预测定位区间内的开放阅读框（ORF，open reading frames）。试验DNA均采用CTAB法提取，水稻材料播种后14 d取嫩叶提取DNA，使用在线软件Primer 5.0设计定位用引物（表1）。PCR反应体系：25 μL 2 × Rapid Taq Master Mix（诺唯赞），上游引物2 μL，下游引物2 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O 19 μL。PCR扩增程序：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 15 s，共30个循环；72℃ 5 min，分别扩增出这些ORF的序列，测序并比对分析其在丰锦和突变体中的序列差异，引物合成和测序由上海生工有限公司北京分公司完成。

表1 本研究的引物列表

Table 1 List of primers used in this study

引物名称 Primer name	上游引物（5′-3′） Forward primer（5′-3′）	下游引物（5′-3′） Reverse primer（5′-3′）	作用 Function
P1	ACACAGGGATCGATCGAGAG	GACCATCGCTTCTGCAGTTC	精细定位
P2	TTTTTATACGCTAGTAAATTGG	TTTTCAAACTCAACAAATTAAGA	精细定位
P3	GTGTCGCCCTTCATCCTAGA	AGATCGTGCGGTCAAGAAAT	精细定位
P4	TGGGTTCATCACTGGTATGC	TGGAGCCAAGTCTACAGCAA	精细定位
P5	CCTCGAGCATCTCCACCAC	GCTACGGTCTCGTTCTGCTC	精细定位
P6	TTTCCTTGGTGGCTAAGAGTC	GGATACGTCGCATTTCGTTT	精细定位
oself3-1-Cas9	GGCATTCAGAACCCTCCAATGAGAA	AAACTTCTCATTGGAGGGTTCTGAA	CRISPR/Cas9靶位点
oself3-1	TTCAGAACCCTCCAATGAGAA	TCATCGATGGTTGCGACTAA	CRISPR/Cas9鉴定
OsARID3-RNAi-positive	ATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAA	AGCTGGACTGGACGCATACAT	RNAi
OsARID3-RNAi-reverse	TATATGTATGCGTCCAGTCCAG	ATAAAAACCCATCTCATAAATAAC	RNAi
Actin	TCCATCTTGGCATCTCTCAG	GTACCCGCATCGGCATCTG	qRT-PCR
OsELF3-1	CATGATCGTCGTCGACCTCCTC	TCATCGTCCCGACAGGTAGGAG	qRT-PCR
OsARID3	TTGCCCTCCCGCATTG	CGAATGGTGCACGGACAA	qRT-PCR
OsARID3-RNAi	GTTCGGAGAACCAAAGATTG	GTCCATGGAGAGTGACAACTGCCGA	qRT-PCR
OsELF3-1-BD	CGGGATCCATGGCGACGAGGGGAGGAGGCGGAGGAG	GAGCTCTCAATCATCTCGTTGCCGTTCCATTTGT	酵母双杂
OsARID3-AD	CGGGATCCATGGCCCAGTTTAGGTCTGCGCCTGTGG	GAGCTCTTACTTTGACTGCTCGAATGGTGCACGG	酵母双杂

1.3 CRISPR/Cas9载体构建与遗传转化

根据OsELF3-1的基因组序列，在CRISPR-GE（http：//skl.scau.edu.cn/targetdesign/）进行靶位点设计（表1），构建CRISPR/Cas9载体（pRGEB32）^［

20］。利用农杆菌介导法，将构建好的CRISPR/Cas9农杆菌载体活化后侵染已培养30 d的野生型笹锦愈伤组织，将愈伤组织阴干后共培养3 d（暗培养，20~25℃），之后转移到筛选一培养基（潮霉素）上培养15 d（培养箱30℃光照10 h，28℃暗培养14 h），将原始愈伤周围新长的、贴着培养基的愈伤用镊子轻轻转移到筛选二培养基（潮霉素及头孢）上，放在与筛选一培养基相同条件的培养箱里培养10 d，按照以上筛选标准挑出符合条件的愈伤，均匀撒在分化培养基上，约40 d分化出幼苗。PCR反应体系及扩增程序同1.2，利用PCR反应鉴定转基因阳性植株。跨越靶点设计引物（表1），直接测序检测阳性转基因植株靶位点的突变情况。选取基因突变的株系与野生型笹锦在培养箱内（14 h光照30℃/ 10 h黑暗22℃）共同培养14 d后观察根系表型并拍照，鉴定其功能。

1.4 RNAi转基因植株载体构建、RNA提取及鉴定

根据OsARID3序列进行RNAi载体构建，分别通过Kpn Ⅰ/Sal Ⅰ和 BamH Ⅰ/Sac Ⅰ限制性内切酶将同一特异性片段以正向和反向连接到RNAi表达载体上，根据载体和基因的CDS序列设计引物（表1）。利用与CRISPR/Cas9遗传转化相同的农杆菌介导法转化到野生型笹锦株系愈伤组织中，在上述特异性片段序列中选择150~200 bp设计引物进行qRT-PCR（表1），取T₀代植株叶片检测RNAi植株的OsARID3表达量，3次生物学重复，3次技术重复。分别取拔节期和齐穗期野生型笹锦及OsARID3-RNAi的根、茎、叶、穗提取RNA。利用普洛麦格公司Eastep® Super Total RNA Extraction Kit的RNA提取试剂盒提取根、茎、叶、穗的RNA，利用康为世纪公司的 HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix反转录试剂盒合成cDNA，cDNA应立即使用或保存于-20℃备用。采用实时荧光定量PCR仪，测定基因的表达，3次生物学重复，3次技术重复，以水稻Actin为内参，反应体系包括反转录产物2.5 µL，前后引物各0.4 µL，PCR预混液（2×SGExcel FastSYBR Mixture）10 µL，100 × ROX Reference Dye 0.4 µL，ddH₂O 6.3 µL。扩增程序为95℃ 3 min；95℃ 5 s，60℃ 20 s，共40个循环；熔解曲线分析程序为95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，利用QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System收集荧光，基因相对表达量采用2^-∆∆CT［

21］方法计算。野生型笹锦和OsARID3-RNAi植株在培养箱内（30℃光照10 h，28℃暗培养14 h）培养14 d后，将野生型笹锦与OsARID3-RNAi的根系进行对比并拍照。

1.5 OsARID3生物信息学分析

利用在线工具InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）对蛋白质结构域进行预测。在数据库（https：//snp-seek.irri.org/index.zul）查找目标基因在3010份种质资源中的SNP^［

22］，利用在线工具https：//www.chiplot.online/对目标基因的SNP进行进化树制图。在网站https：//ricevarmap.ncpgr.cn/vars_in_ gene/进行单体型分析^{［参考文献 23

百度学术}23］。

1.6 酵母双杂

为了解析OsELF3-1的基因功能，对OsELF3-1进行酵母双杂交，筛选出与OsELF3-1互作的OsARID3。利用SnapGene软件设计带有BamH Ⅰ和Sac Ⅰ酶切位点的引物（表1），将克隆好的OsELF3-1与OsARID3的CDS序列片段分别连接到双酶切成功的pGBKT7（BD）和pGADT7（AD）载体上，构建好的载体分别为pGBKT7-OsELF3-1和pGADT7-OsARID3。阳性对照的共转质粒为pGBKT7-53（具有自激活活性）与pGADT7-T（AD空载），阴性对照的共转质粒为pGBKT7-Lam（BD空载）与pGADT7-T。酵母自激活采用阳性对照、阴性对照、pGADT7-T空载及构建好的pGBKT7-OsELF3-1载体，自激活试验培养基为Servicebio公司提供的二缺培养基（SD/-Leu/-Trp）及四缺培养基（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade），观察阳性对照、阴性对照、pGADT7-T空载及构建好的pGBKT7-OsELF3-1共转酵母在二缺和四缺培养基上的生长情况，pGBKT7-OsELF3-1与pGADT7-T空载的共转酵母在二缺及四缺培养基上均无法生长，可以进行后续试验。为了验证OsELF3-1与OsARID3的互作作用是准确无误的，将pGBKT7-OsELF3-1与pGADT7-OsARID3共转化到酵母Y2H-Gold感受态中，涂二缺培养基，30℃培养3 d，挑取单克隆进行酵母细胞培养，培养至适当的OD值，测OD₆₀₀=0.55，取10 µL菌液分别稀释10倍、100倍和1000倍，在Servicebio公司提供的SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade培养基上培养生长。

2 结果与分析

2.1 oself3-1突变体根系表型鉴定及图位克隆

前期于筛选笹锦突变体库发现突变体oself3-1根系较野生型笹锦的根系明显变短（图1A），将突变体与野生型笹锦杂交获得F₁植株，F₁植株自交得到包含124个植株的F₂群体，调查F₂群体表型发现有30株与oself3-1表型相似（根系长度大于5 cm），而有94株与野生型笹锦表型相似（根系长度大于10 cm），分离比经卡方检验符合3：1分离比（χ²=0.011）（图1B），说明突变体较野生型笹锦根系变短由一个隐性单基因引起。利用突变体与丰锦杂交获得的F₂群体进一步精细定位，将目标基因锁定在第6染色体分子标记P2和P5之间一段50.9 kb的区间内，比对数据库发现该区间内共含有4个开放阅读框（ORF1~4），通过测序比对发现突变体和丰锦只在ORF4上存在多态性，测序结果显示突变体中ORF4在第二个外显子上有7个碱基的缺失，导致其因移码而提前终止（图1C）。ORF4（OsELF3-1）与拟南芥中ELF3蛋白的编码基因同源，水稻中OsELF3-1已被克隆，并有报道称其参与抽穗期和耐盐性的调控^［

14-16］，但尚未见其调控水稻根系生长的报道，本研究结果说明OsELF3-1可能具有调控根系的新功能。

图1 突变体根部表型分析及精细定位

Fig. 1 Root phenotype of the mutant and its fine mapping

A：野生型笹锦（Sasa）与oself3-1突变体根系长度差异；B： F₂群体根系长度与植株数量；C：定位区间内预测的ORF及候选基因OsELF3-1（LOC_Os06g05060）的基因结构及在丰锦（Toyo）和oself3-1的序列差异，红色箭头表示候选ORF，红色字母表示ORF4在丰锦和oself3-1突变体之间的序列变异，-为碱基缺失

A： Differences in the root system of wild type Sasaishiki （Sasa） and oself3-1 mutant； B： Root length and number of plants in F₂ population； C： Predicted ORFs in the location interval and gene structure of the candidate gene OsELF3-1 （LOC_Os06g05060） and the sequence difference between Toyonishiki （Toyo） and oself3-1， the red arrow indicates the candidate ORF， the letters in red color indicate the sequence variation of ORF4 between Toyonishiki and oself3-1 mutant， - is the missing base

2.2 OsELF3-1基因编辑植株鉴定及根系表型分析

为了验证OsELF3-1参与调控水稻根系生长，在粳稻品种野生型笹锦遗传背景下通过CRISPR/Cas9技术构建了OsELF3-1敲除突变体（T-cr1和T-cr2），测序结果表明T-cr1和T-cr2分别在第3个外显子上有2个碱基和1个碱基的缺失（图2A）。调查培养14 d的幼苗根系发现，T-cr1和T-cr2的根系均显著短于野生型笹锦的根系，野生型笹锦根系长度达到10 cm以上，但是突变体根系长度未达到5 cm（图2B、C），验证了OsELF3-1参与调控水稻根系生长。对野生型笹锦齐穗期的根、茎、叶片及穗进行qRT-PCR试验测定OsELF3-1表达量，发现OsELF3-1在水稻根、茎、叶片及穗中均有表达，在叶片中表达量最高（图2D）。

图2 CRISPR/Cas9技术构建OsELF3-1敲除突变体的验证及根系表型变化

Fig. 2 Validation of OsELF3-1 knockout mutant constructed by CRISPR/Cas9 technology and root phenotypic changes

A： OsELF3-1的基因结构及在野生型笹锦和oself3-1突变体中的序列差异，T-cr1、T-cr2分别为oself3-1的两个突变体；B：野生型笹锦及oself3-1突变体的幼苗根系性状对比；C：野生型笹锦及突变体根系长度的变化，不同字母表示差异显著（P < 0.05），下同；D：野生型笹锦不同器官中OsELF3-1的相对表达量

A： Gene structure of the candidate gene OsELF3-1 and the sequence difference between wild type Sasaishiki and oself3-1， T-cr1 and T-cr2 are two mutants of oself3-1， respectively； B： Comparison of seedling root traits between Sasaishiki and oself3-1 mutants； C： Changes in root length in Sasaishiki and mutant organisms， different letters indicate significant differences （P＜0.05），the same as below； D： Relative expression of OsELF3-1 in different organs of Sasaishiki

2.3 OsELF3-1互作蛋白的筛选

为了解析OsELF3-1调控水稻根系生长的基因网络，通过酵母双杂交筛库筛选OsELF3-1的互作蛋白。四缺培养基酵母自激活结果显示OsELF3-1没有自激活现象（图3A），可以开展后续验证实验，结果发现OsELF3-1可能与OsARID3互作。为了进一步验证这一结果，将构建好的pGBKT7-OsELF3-1和pGADT7-OsARID3的重组质粒共转入酵母感受态细胞中，OsARID3与OsELF3-1共转的酵母细胞能够在二缺培养基上正常生长，说明OsARID3与OsELF3-1均已经全部转化进酵母细胞中。吸取菌液进行稀释后，微量点在四缺培养基上，结果显示菌液能够正常生长，说明OsELF3-1与OsARID3存在互作关系（图3B）。

图3 OsELF3-1酵母双杂交筛选互作蛋白

Fig. 3 OsELF3-1 yeast two-hybrid screening of interacting proteins

A： OsELF3-1的自激活验证，QDO：四缺培养基；B： OsELF3-1与OsARID3的互作验证，10^-1：菌液稀释10倍，10^-2：菌液稀释100倍，10^-3：菌液稀释1000倍，DDO：二缺培养基

A： Self-activation verification of OsELF3-1， QDO： Synthetic dextrose minimal medium without adenine， histidine， leucine， tryptophan；B： Identification of interaction between OsELF3-1 and OsARID3， 10^-1： The bacterial solution is diluted 10 times， 10^-2： The bacterial solution is diluted 100 times， 10^-3： The bacterial solution is diluted 1000 times， DDO： Synthetic dextrose minimal medium without leucine， tryptophan

2.4 OsARID3的结构域功能分析及OsARID3-RNAi株系表型鉴定

基因结构分析发现OsARID3有15个外显子，采用InterPro对蛋白质功能结构域进行分析，蛋白质结构域中含有ARID功能结构域（ARID3 DNA binding domain）、α-晶体蛋白/热休克蛋白20结构域（α-crystallin/Hsp_domain）、热休克蛋白20（HsP20）等结构域，OsARID3结构域中还存在依靠钾离子的钠离子/钙离子交换的结构域（K⁺-dependent and Na⁺/Ca⁺ exchange domain）（图4A）。OsARID3在野生型笹锦的根、茎、叶、穗中均有表达，在穗部表达量最高（图4B）。为了进一步验证OsARID3的功能，使用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了OsARID3的敲除突变体，但是所有纯合突变植株全部致死，暗示其在水稻生长发育过程中起至关重要的作用。进一步构建了两个OsARID3的RNAi株系，对构建好的RNAi转基因植株进行定量分析，发现T-RNAi-1及T-RNAi-2中OsARID3的表达量显著低于野生型笹锦（图4C）。对培养7 d的幼苗根系进行对比，发现T-RNAi-1及T-RNAi-2的根系短于野生型笹锦的根系（图4D），说明OsARID3参与水稻根系生长调控。

图4 OsARID3结构域预测及OsARID3-RNAi突变体的根系变化

Fig. 4 Domain prediction of OsARID3 and root changes of OsARID3-RNAi mutants

A： OsARID3蛋白功能结构域预测；B：野生型笹锦不同器官中OsARID3的相对表达量；C：野生型笹锦、T-RNAi-1及 T-RNAi-2中OsARID3的相对表达量，T-RNAi-1、T-RNAi-2为OsARID3的RNAi植株；D：野生型笹锦与OsARID3-RNAi根系性状比较

A： Prediction of functional conserved domain of OsARID3 protein； B： Relative expression levels of OsARID3 in different organs of wild type Sasanishiki； C： Expression of OsARID3 in Sasaishik， T-RNAi-1 and T-RNAi-2， T-RNAi-1 and T-RNAi-2 are the RNAi plants of OsARID3； D： Comparison of Sasaishiki and OsARID3-RNAi root traits

2.5 OsARID3的生物信息学分析

为了进一步分析OsARID3的自然变异分布和其进化规律，对3010份水稻种质资源测序数据进行分析，发现OsARID3的基因组DNA区域在3010份种质资源种中存在丰富的多态性，包括50个SNP和11个InDel（图5A）。进化树分析结果表明OsARID3存在明显的籼稻、粳稻分化（图5B）。单倍型分析表明OsARID3可以分为15种单体型，其中粳稻主要属于单倍型I、IV和VI（图5C）。

图5 OsARID3的序列单倍型分析

Fig. 5 Sequence haplotype analysis of OsARID3

A： SNP和InDel的多态性分布；B： OsARID3的聚类分析，Aus：孟加拉稻，XI_Admix：籼稻混合类型，XI-Ⅰ/ XI-Ⅱ/ XI-Ⅲ：籼稻亚群，Intermediate：中间类型，GJ_Admix：粳稻混合类型，Tem_GJ：粳稻亚群温带粳稻，Tro_GJ：热带粳稻；C： OsARID3的单倍体分析，Ⅰ~ⅩⅤ：不同单倍型类型

A： SNP and InDel polymorphism distribution； B： Cluster analysis of OsARID3， Aus： Aus， XI_Admix：Indica admix， XI-Ⅰ/ XI-Ⅱ/ XI-Ⅲ：Indica， Intermediate： Intermediate type， GJ_Admix：Japonica admix， Tem_GJ：Temperate japonica， Tro_GJ：Tropical japonica； C： Haploid analysis of OsARID3， Ⅰ-ⅩⅤ： Different haplotype types

3 讨论

水稻根系的发育是一个复杂的生物学过程，参与该过程的基因众多，因此目前已经克隆的根系发育调控基因往往具有一因多效性。OsELF3-1是拟南芥AtELF3的同源基因，在拟南芥中，ELF3、ELF4和LUX形成晚间复合体（EC，evening complex），直接调节植物生长^［

24］。水稻中OsELF3-1同样可以与OsLUX和OsELF4s形成三元复合体OsEC。OsEC可以直接抑制Ghd7，增强下游Ehd1、Hd3a和RFT1的表达，促进水稻开花，还可以直接作用于OsGI进而调控水稻的耐盐性^{［参考文献 16

百度学术}16］。然而OsELF3-1是否能与其他转录因子互作，调控其他生物学进程仍然未知。本研究通过酵母双杂交筛库发现OsELF3-1与一个能与富含AT的DNA特异结合的关键转录调控因子OsARID3互作。OsARID3参与生长素及细胞分裂素相关通路，osarid3突变体的愈伤组织中生长素浓度增加，但细胞分裂素浓度降低，根系无法长出，说明OsARID3与根系生长发育有关^{［参考文献 25

百度学术}25］。本研究发现OsARID3的纯合突变体致死，因此利用RNAi技术构建OsARID3-RNAi突变体，突变体的根系短于野生型笹锦。综上所述，OsARID3-RNAi植株根系与oself3-1突变体植株根系均短于野生型笹锦植株根系，说明OsELF3-1可能通过与OsARID3互作调控水稻根系生长。ARID蛋白在植物的生长发育和细胞分化等生物进程有重要作用^{［参考文献 26-27}26-27］，ARID具有能特异地结合于靶基因的AT-rich DNA序列的DNA-binding蛋白，蛋白质结构域还有属于热蛋白家族的α-crystallin及HSP20，热蛋白家族在植物生长发育及逆境生理中发挥作用，因此OsARID3基因可能与水稻胁迫机制有关^{［参考文献 25

百度学术}25， 28-29］。同时拟南芥ELF3蛋白的类朊病毒结构域（PrD，prion like virus domain）能够感受外界温度信号，促使ELF3蛋白发生相变，在活化和非活化状态间转换，是植物中重要的热感受器^{［参考文献 30

百度学术}30］，暗示水稻中OsARID3和OsELF3-1可能也同时参与对温度的响应和水稻胁迫相关机制。根系变短也可能会导致水稻植株的耐盐性和抗旱性的减弱，对外源生长素及细胞分裂素更敏感，导致生长素的极性运输受到影响^{［参考文献 10-11}10-11， 31-32］。因此OsELF3-1和OsARID3在植物生长发育及非生物胁迫机制方面的更多功能值得更深层次的研究。

水稻中ELF3的另一个同源基因编码蛋白为 OsELF3-2，OsELF3-2的T-DNA插入突变体与OsELF3-1敲除突变体表型相似，在长短日照下都通过延长基础营养生长期来延迟抽穗^［

15， 33］。与OsELF3-1相似，OsELF3-2的T-DNA插入突变体根长较野生型变短^{［参考文献 32

百度学术}32］，暗示OsELF3-1和OsELF3-2在生育期和根系发育上具有相似的功能。此外OsELF3-2可以与E3连接酶APIP6相互作用，影响稻瘟病抗性^{［参考文献 17

百度学术}17］，暗示水稻中两个ELF3同源物还存在不同作用机制调控相应的性状。OsLUX与OsELF3-1和OsELF3-2的相互作用相似，而与OsELF3-2相比，OsELF3-1与OsLUX的相互作用更强^{［参考文献 34

百度学术}34］，这种与OsLUX相互作用强度的变化可能是OsELF3-1和OsELF3-2不同功能的分子基础，OsELF3-1主要作为连接OsELF4s和OsLUX的桥梁，进而实现转录抑制。相反OsELF3-2可能在转录后水平上发挥作用，通过与不同蛋白质的相互作用增强病原体免疫力^{［参考文献 34

百度学术}34］。综上所述，阐明协同调控OsELF3-1和OsELF3-2的分子机理，对同时改良水稻品种生育期、根长、稻瘟病抗性等重要农艺性状具有深远意义，OsELF3-1和OsELF3-2是水稻分子设计育种的重要改良位点。

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