基于<bold>QTL-Seq</bold>的水稻籽粒蛋白含量性状的<bold>QTL</bold>定位

林添资; 孙立亭; 景德道; 余波; 曾生元; 李闯; 钱华飞; 杜灿灿; 胡庆峰; 杨军; 周义文; 巫章平; 龚红兵; LIN Tianzi; SUN Liting; JING Dedao; YU Bo; ZENG Shengyuan; LI Chuang; QIAN Huafei; DU Cancan; HU Qingfeng; YANG Jun; ZHOU Yiwen; Wu Zhangping; GONG Hongbing

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林添资
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江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，句容 212400

最近更新：2025-04-03

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240812001

目录contents

摘要

稻米蛋白质含量是影响稻米品质的重要因素之一，解析稻米蛋白质含量的遗传机制对培育优质食味稻米至关重要。本研究以稻米蛋白质含量有显著差异的镇粳2400和嘉禾218构建的RIL群体为材料，利用QTL-Seq方法对RIL群体中的高、低蛋白质含量极端家系进行混池重测序以定位稻米蛋白含量QTL位点，之后构建局部遗传连锁图谱，通过QTL Ici Mapping 4.1软件验证结果并精细定位。F_8∶9采用△SNP指数法分析得到4个QTL，分别位于第1、2和12染色体；F_9∶10使用ED方法分析得到分布于第1、2、6、7、8、9和11染色体上共8个QTL，其中位于第1染色体的37.64~39.61 Mb区间的QTL与F_8∶9检测到的第1染色体36.07~39.87 Mb区间的QTL重合，该QTL命名为qGPC1，位于标记1-3782~1-3834之间，物理距离为516 kb，表型贡献率和LOD值分别为13.20%和3.91。通过测序分析发现，镇粳2400和嘉禾218在已报道的调控籽粒蛋白质含量基因OsAAP6上无差异，因此该区间可能有一个新的基因调控稻米蛋白质含量。同时从RIL家系中筛选出低蛋白型种质做亲本培育出的镇稻1818，米饭食味分显著高于江苏省同熟期对照品种武运粳23号和优质食味主推品种南粳5055，株高、结实率和千粒重均较武运粳23号和南粳5055显著增加。本研究为进一步克隆稻米蛋白质含量基因及解析遗传调控机制奠定了基础，且提供了可供育种利用的优异种质资源。

关键词

水稻; 食味品质; 稻米蛋白质含量; QTL定位

水稻是我国重要的粮食作物之一，随着人民生活水平的提高，人们对优质食味稻米的需求越来越大。但目前国内稻米食味品质改良仍以直链淀粉含量的调控为研究重点，我国的行业标准（NYC593-2013）也仅从稻米的胶稠度、直链淀粉含量和糊化温度来量化稻米蒸煮食味品质。蛋白质作为稻米中第二大营养物质，仅次于淀粉含量，通过影响淀粉的糊化特性及与淀粉分子链的相互作用而影响食味品质^［

1-2］。许多研究认为，蛋白质含量与食味品质呈显著负相关，一般总蛋白含量大于9%的品种其食味口感通常较差^{［参考文献 3

百度学术}3］。然而，蛋白质含量与食味品质之间不是简单的线性关系，在低蛋白含量范围内（蛋白质含量在3.88%~6.03%之间），蛋白质含量增高尤其是醇溶蛋白和谷蛋白含量增高的稻米，可提升米饭的综合口感^{［参考文献 4

百度学术}4］；蛋白质含量过高或过低都会降低食味品质，只有当蛋白质与直链淀粉相互平衡才会形成优良品质^{［参考文献 5

百度学术}5］。因此，稻米蛋白质含量研究有助于解析蛋白质遗传调控机制，对培育优质食味稻米具有重要的指导意义和参考价值。稻米蛋白质含量主要受遗传因子控制，且是由多基因控制的数量性状。目前为止，人们对控制稻米蛋白质含量的QTL定位已有大量报道，在水稻12条染色体上均有分布。为了得到较为准确的表型，定位群体主要有3类。第1类是重组自交系群体（RIL，recombinant inbred line），钟明等^{［参考文献 6

百度学术}6］和Wang 等^{［参考文献 7

百度学术}7］以珍汕97和南洋占杂交构建的RIL群体定位到6个控制蛋白质含量的QTL，其中位于第1染色体的qpc1和位于第2染色体的qpc2对糙米和精米蛋白质含量均具有较大的作用；Kepiro 等^{［参考文献 8

百度学术}8］利用Cypress和Panda的RIL群体在糙米中定位到2个QTL，精米中定位到3个QTL，其中第1和第4染色体上的QTL同时控制糙米和精米蛋白质含量；张涛等^{［参考文献 9

百度学术}9］利用中优早和丰锦的RIL群体检测到控制糙米蛋白质含量的QTL位点有6个，分别位于第3、6、7、8和11染色体上，联合贡献率为61.07%，其中位于第8染色体的qPC-8-1对糙米蛋白质含量具有主效作用；黄覃等^{［参考文献 10

百度学术}10］利用明恢63和优质泰国香米KDML105的RIL群体于2009年检测到蛋白质含量相关QTL有2个，分别位于第6和第11染色体上，2010年检测到3个，分别位于第3染色体和第12染色体上；鄢宝等^{［参考文献 11

百度学术}11］以华恢3号与中国香稻的RIL群体为材料，定位到3个控制糙米蛋白质含量的QTL，即qpbc4、qpbc6、qpbc8，分别位于第4、6、8染色体上，其中只有qpbc8连续两年被重复检测到；杨亚春等^{［参考文献 12

百度学术}12］用9311和日本晴的RIL群体定位到1个稳定性较高的QTL qBRPC1.3，位于第1染色体上，同时控制糙米蛋白质含量和精米蛋白质含量；张杰等^{［参考文献 13

百度学术}13］利用Sasanishiki/Habataki回交RIL群体检测到与蛋白质含量相关的5个稳定表达的QTL，分别位于第1、8、9和12染色体；Park 等^{［参考文献 14

百度学术}14］利用Hwayeong和Wandoaengmi6的RIL群体在第9染色体上定位到1个QTL qPro9。第2类是染色体片段置换系（CSSL， chromosome segment substitution line），Yang 等^{［参考文献 15

百度学术}15］利用Sasanishiki和Habataki的CSSL鉴定到2个主效QTL qPC-1和qPC-10，分别位于第1和10染色体；赵琳琳等^{［参考文献 16

百度学术}16］以云南元江普通野生稻和特青构建的高代回交群体定位到6个低蛋白QTL，分别位于第1、7和10染色体；Takayuki 等^{［参考文献 17

百度学术}17］利用Koshihikari和Nona Bokra的CSSL鉴定到1个稳定的QTL TGP12，该QTL能特异降低蛋白质含量而不影响食味品质；王小雷等^{［参考文献 18

百度学术}18］利用昌恢121和越光构建CSSL群体，鉴定出2个稳定表达的QTL qPGWC1和qPaT12，分别位于第1和12染色体。第3类是自然群体，有研究者利用水稻自然群体进行全基因组关联分析，挖掘控制稻米蛋白质含量的QTL，但检测到的QTL数量极少^{［参考文献 19-20}19-20］。由于稻米蛋白质含量影响因素众多，如抽穗期和栽培措施等，因此对检测到的QTL难以进行更深入的研究，以至于QTL克隆鲜为报道。Peng 等^{［参考文献 21

百度学术}21］首次克隆了调控籽粒蛋白质含量的基因OsAAP6/qPC1，该基因编码一个假定的氨基酸通透酶，能够正向调控籽粒蛋白质含量，在OsAAP6的5′非翻译区顺式调控元件中的两个自然变异可能与籼稻中籽粒蛋白质含量的多样性相关；Yang 等^{［参考文献 22

百度学术}22］克隆了qGPC10基因，该基因编码谷蛋白A2前体（OsGluA2），启动子上的序列差异导致籼粳亚种蛋白质含量存在差异。因此，进一步挖掘控制稻米蛋白质含量的QTL位点或关键基因，将为稻米品质育种提供更多有利基因资源，加快稻米品质育种效率。前人应用的定位群体大多基于双亲分子标记的多态性考虑，采用籼粳杂交策略构建定位群体，尽管鉴定出了一系列的控制稻米蛋白质含量的QTL，但在育种上有利用价值的QTL和高效的分子标记极少。鉴于第二代测序技术和混合池分组分析法（BSA-Seq， bulked segregated sequencing，又称QTL-Seq）具有快速、准确和廉价的特点，本研究针对长江中下游粳稻稻米蛋白质含量偏高且稻米食味欠佳的现状，利用低蛋白质含量种质镇粳2400和优质长粒粳稻品种嘉禾218构建RIL群体。前期研究表明，该群体抽穗期变幅大，由主效基因Hd1和Ehd1控制；镇粳2400中Hd1基因第一外显子处存在123 bp碱基插入导致Hd1功能丧失，表现为光周期钝感，同时，Ehd1基因编码区655 bp处G替换为A导致Ehd1功能丧失，抽穗期延迟，即hd1+ehd1；Hd1和Ehd1的4种组合，即Hd1+Ehd1、hd1+Ehd1、Hd1+ehd1和hd1+ehd1，不同组合的抽穗期各不相同^{［参考文献 23

百度学术}23］。由于蛋白质含量受抽穗期影响较大，本研究在每种组合下分别选取蛋白质含量极端家系构建极端池，采用QTL-Seq技术挖掘稻米蛋白质含量相关的QTL，以期为稻米食味品质改良提供优异种质和高效分子标记。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水稻种质镇粳2400是由镇稻育种中间材料经N-亚硝基-N-甲基脲（MNU，N-Nitroso-N-Methylurea）诱变而来，属于优质中粳稻，抽穗期96.6±1.52 d；嘉禾218是嘉兴市农业科学研究院与中国水稻研究所联合培育的优质早熟晚粳稻，抽穗期105.2±1.10 d。以镇粳2400/嘉禾218 通过单籽传法获得一套包含268个株系的RIL群体（F_8∶9）。镇稻1818是利用RIL群体筛选到的低蛋白质含量种质与镇稻18号杂交创制的新种质，属于早熟晚粳；对照品种南粳5055是江苏省农业科学院粮食作物研究所选育的半糯型优质食味品种，属于早熟晚粳，用于食味品质对照；武运粳23号是常州市武进区农业科学研究所选育的早熟晚粳稻区试对照品种，达到国标三级优质稻谷标准。

1.2 田间试验

镇粳2400和嘉禾218于2021年和2022年正季种植（预备试验），其余试验材料于2022年和2023年正季种植，均种植在江苏丘陵地区镇江农业科学研究所行香试验基地。5月15日播种，6月15日移栽，单苗栽插，每份材料种植4行，每行12株，株行距16.5 cm×19.8 cm，常规水肥管理。待成熟后收获每个材料的中间2行，边棵不收，共计20株，脱粒后室温下储存3个月备用。

1.3 籽粒蛋白质含量测定

RIL群体及亲本的成熟水稻种子经出糙机（FC2K， Otake， Janpan）脱壳制成糙米，糙米由精米机（VP-32， Yamamoto， Japan）研磨制成精米。蛋白质含量测定采用米粒食味计（RLTA10B-K，SATAKE）进行测定，每份材料测定3次，取均值作为该株系的表型值进行分析。

1.4 农艺性状、米饭食味分及理化指标测定

镇稻1818、武运粳23号和南粳5055于成熟期（按95%以上谷粒黄熟、米质坚实的标准）调查株高、每公顷有效穗、每穗粒数、结实率和千粒重农艺性状及全生育期（播种期至成熟期的天数），每份材料调查5株。参照米饭食味仪（STA1A，SATAKE）使用说明书测定米饭外观、口感和综合评分，每份材料测定4次。垩白粒率和垩白度使用SC-E型大米外观品质检测分析系统（万深），每份材料测定4次。胶稠度、蛋白质含量和直链淀粉含量委托华智生物技术有限公司测定。镇粳2400和嘉禾218蛋白质含量分析采用t-测验，镇稻1818、武运粳23号和南粳5055农艺性状及稻米品质指标分析采用邓肯测验。

1.5 全基因组重测序QTL-Seq关联分析

在镇粳2400和嘉禾218的RIL群体中，按双亲的抽穗期差异基因Hd1和Ehd1的4种基因型组合，分别取蛋白质含量最高和最低的10%的单株构建高、低蛋白质含量极端池。选取的极端单株采用CTAB法提取DNA后，等量混合成F_8∶9的高、低蛋白极端池和F_9∶10的高、低蛋白极端池。通过Illumina HiSeq对F_8∶9两个极端池、F_9∶10两个极端池和两个亲本进行全基因组重测序，亲本和极端池的平均测序深度为30×。测序数据经过筛选过滤去除低质量数据，得到Clean Reads；使用BWA软件将数据与水稻参考基因组日本晴（http：//plants.ensembl.org/Oryza_sativa/Info/Index）序列进行比对，通过比对定位Clean Reads在参考基因组上的位置，结合GATK软件对双亲及混池的序列进行比对和SNP读取^［

24-25］，QTL位点搜索采用△SNP指数法和欧氏距离法（ED，euclidean distance）两种分析方法进行计算^{［参考文献 26

百度学术}26］。全基因组重测序由南京英德尔生物技术有限公司完成。

1.6 局部遗传图谱构建及QTL分析验证

根据重测序结果获得双亲具有差异的基因组结构，开发出特异性SNP标记，筛选亲本间有多态的SNP标记（表1），利用这些标记检测RIL群体家系的基因型，通过QTL Ici Mapping 4.1软件，分析多态性标记之间的遗传连锁关系，构建目标基因所在区间的连锁遗传图谱。SNP基因型检测委托景肽生物有限公司完成。OsAAP6基因测序委托南京思普金生物技术有限公司完成。PCR扩增反应体系：基因组DNA 1 μL（50 ng/uL），2×pfu Mix Buffer 25 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，ddH₂O 22 μL。PCR扩增程序为：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，35个循环数；终延伸7 min。

图1　亲本和RIL的籽粒蛋白质含量及抽穗期分布

Fig. 1　Distribution patterns of grain protein content and heading date in parents and RIL

A：镇粳2400和嘉禾218的籽粒蛋白质含量，***分别代表在P<0.001水平上显著差异；B：RIL家系的籽粒蛋白质含量分布；C：RIL家系抽穗期；D：不同抽穗期类型的RIL家系蛋白质含量

A： Grain protein content in Zhengeng 2400 and Jiahe 218， *** respectively representing significant differences at the P<0.001 level； B： Grain protein content distribution in RIL； C： Heading date of RIL； D： Grain protein content of RIL with different heading date

表1 基因定位SNP标记和OsAAP6基因测序引物

Table 1 Primer sequences of SNP markers for gene mapping and OsAAP6 gene sequencing

标记 Marker	物理位置（bp） Position	引物序列（5′-3′） Primer sequence（5′-3′）
1-3764 F	37643035	GTATTCGTGATCCATTTCATGTTG
1-3764 Rg	37643035	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTATGTAACGGTCAGGTATAAGTTCAG
1-3764 Rc	37643035	GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTATGTAACGGTCAGGTATAAGTTCAC
1-3782 F	37825493	GTGAGCTGCCATGACGCC
1-3782 Ra	37825493	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGGCGTGGAAGAAGACGA
1-3782 Rg	37825493	GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGGCGTGGAAGAAGACGG
1-3806 Fc	38060795	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTTTTGTTAATTATCCCGTGACTAC
1-3806 Ft	38060795	GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTTTTGTTAATTATCCCGTGACTAT
1-3806 R	38060795	CAAACCATTCCAATACTTCGCA
1-3834 F	38341969	CGTTGTTGTTCCCCCGG
1-3834 Rg	38341969	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAGGTCGTGCGCCCTG
1-3834 Ra	38341969	GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGAAGGTCGTGCGCCCTA
1-3876 Fa	38762634	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACATATCTATATAGTATCGGCCTTCAGCA
1-3876 Ft	38762634	GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACATATCTATATAGTATCGGCCTTCAGCT
1-3876 R	38762634	AACCGAGAAAGCAGAGCGAA
1-3960 Fg	39602780	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTGCAAATAGGCGTGATCCATTTG
1-3960 Fa	39602780	GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGCAAATAGGCGTGATCCATTTA
1-3960 R	39602780	ATCTGCATTGAAAGGGGCCA
OsAAP6-F1	38136496	CTCAAAATCCTTTCCGCTCAG
OsAAP6-R1	38137749	CCACTTGGACTTGGTAGGGTAT
OsAAP6-F2	38137597	TTACTAGGACAACGTGAAGGATAG
OsAAP6-R2	38138955	AACAAAATTCAGTTTCGTCAGTG
OsAAP6-F4	38139928	GCGTCACGACCGTCTTCTAC
OsAAP6-R4	38140674	ACCATACTCCTCAAGTCCCAT
OsAAP6-F5	38138660	GATGGAATCCTGGAGATCCTTTTG
OsAAP6-R5	38139382	TCGTAGCGGTCGTGATGGTGT
OsAAP6-F6	38138943	ACGCAAGAATGGCACTGACGAAA
OsAAP6-R6	38140201	CCAGCTTGCACAGCGTGAACC
OsAAP6-1-f	38134303	GGTGAAGGAAAACCACAGCCG
OsAAP6-1-r	38135699	CCGCCACGAAGCACACATTG
OsAAP6-2-f	38135363	ATATGACGACACGTGAGGCTGT
OsAAP6-2-r	38136838	TCAACGGTATGTGGTGACAATG

2 结果与分析

2.1 双亲及RIL群体的籽粒蛋白质含量表型

镇粳2400在2021年和2022年的籽粒蛋白质含量都在6.5%左右，而嘉禾218的籽粒蛋白质含量均在8.6%左右，双亲的籽粒蛋白质含量在年际间表现较为稳定，且双亲连续两年都存在极显著差异（图1A）。重组自交系（RIL）的籽粒蛋白质含量分布于5.4% ~12.0%，中亲值偏向低蛋白质含量，表现出连续分布和显著的超亲分离（图1B），表明该性状由多基因控制。

该RIL家系抽穗期变化幅度较大，前期研究表明控制抽穗期的主效基因为Hd1和Ehd1^［

23］，而RIL家系的蛋白质含量在Hd1和Ehd1不同基因型间存在差异，具体表现为hd1+Ehd1抽穗期84.79 d，RIL家系蛋白质含量均值为9.40%；hd1+ehd1抽穗期为95.46 d，RIL家系蛋白质含量均值为8.80%；Hd1+Ehd1抽穗期为105.38 d，RIL家系蛋白质含量均值为7.20%；Hd1+ ehd1抽穗期为114.03 d，RIL家系蛋白质含量均值为6.20%（图1C、D）。不同基因型间表现出随抽穗期的延迟而蛋白质含量降低的趋势。

2.2 RIL家系蛋白质含量极端选取及QTL-Seq混池重测序

由于RIL家系的蛋白质含量随抽穗期的延迟而降低（图1C、D），基因型hd1+Ehd1共72份家系，蛋白质含量最低为7.5%，最高为12.4%，基因型hd1+ehd1共54份家系，蛋白质含量最低为6.2%，最高为10.3%，基因型Hd1+Ehd1共106份家系，蛋白质含量最低为5.9%，最高为10.5%，而基因型为Hd1+ehd1的共36份家系，蛋白质含量最低为5.4%，最高为9.3%（图2），为了排除Hd1和Ehd1基因对定位蛋白质含量相关QTL的影响，按Hd1和Ehd1基因型组合选取10%的极端个体（表2），根据此标准，从F_8∶9的RIL中挑选出高蛋白质含量的极端株系25个，低蛋白质含量的极端株系28个；从F_9∶10的RIL中挑选出高蛋白质含量的极端株系25个，低蛋白质含量的极端株系22个（表2）。

图2 不同的抽穗期基因型家系的蛋白质含量分布

Fig. 2 Distribution of protein content in RILs with different genotypes of heading date

表2 蛋白质含量极端家系挑选标准与个数

Table 2 Selection criteria and number for lines with extreme protein content

基因型 Genotype	家系数量 Number of lines	高蛋白极端家系含量（%） The standard for extreme lines with high protein	低蛋白极端家系含量（%） The standard for extreme lines with low protein	高蛋白极端家系个数 Number of extreme lines with high protein content		低蛋白极端家系个数 Number of extreme lines with low protein content
基因型 Genotype	家系数量 Number of lines			F_8∶9	F_9∶10	F_8∶9	F_9∶10
hd1+Ehd1	72	≥11.0	≤7.5	7	7	7	6
hd1+ehd1	54	≥9.0	≤7.0	6	5	6	5
Hd1+Ehd1	106	≥8.5	≤6.5	8	10	11	9
Hd1+ehd1	36	≥8.0	≤6.0	4	3	4	2
合计Totle	268			25	25	28	22

对亲本镇粳2400、嘉禾218和4个混池进行全基因组重测序，镇粳2400和嘉禾218分别获得11.82 Gb和10.67 Gb高质量总碱基序列，F_8：9高低混池分别获得12.51 Gb和11.57 Gb的高质量碱基序列，F_9：10高低混池分别获得13.33 Gb和12.90 Gb的高质量碱基序列，测序深度约为25~32×。总体样品的GC含量在41%~43%之间，Q20均大于96%，Q30均大于91%，测序数据充足，质量较高，将过滤后的序列比对到水稻日本晴参考基因组上，6个样品与参考基因组的比对率在98.54%~99.20%之间，比对率高，可用于后续目标QTL的定位（表3）。经过序列比对和SNP位点提取，将F_8∶9和F_9∶10极端混池共得到的SNP和InDel位点与两亲本进行比较，过滤不一致的位点后，F_8∶9共有978999个SNP和InDel位点，F_9∶10共有938767个SNP和InDel位点用于QTL-Seq分析。

表3 全基因组重测序结果

Table 3 Result of whole genome resequencing

数据的质量指标 Quality of data output	镇粳2400 Zhengeng 2400	嘉禾218 Jiahe 218	F_8∶9低蛋白池 F_8∶9LP-Pool	F_8∶9高蛋白池 F_8∶9 HP-Pool	F_9∶10低蛋白池 F_9∶10 LP-Pool	F_9∶10高蛋白池 F_9∶10 HP-Pool
原始测序读数 Raw reads	79381740	71597982	77642488	83963220	86657424	89637122
原始数据的总碱基数（bp） Raw bases	11907261000	10739697300	11646373200	12594483000	12998613600	13445568300
质量清理后读数 Cleaned reads	78924050	71234480	77269480	83530060	86085918	88936900
高质量数据的总碱基数（bp） Cleaned bases	11817033900	10667141054	11571778444	12509203080	12899711423	13327540729
Q20 （%）	97.08	97.32	97.42	97.21	97.19	96.96
Q30 （%）	91.89	92.40	92.58	92.12	92.22	91.81
GC含量（%） GC content	42	41	41	41	43	43
与参考基因组的比对率（%） Comparison rate with reference genome	99.20	98.84	98.78	98.54	99.00	99.00

LP：Low protein content； HP： High protein content

2.3 籽粒蛋白质含量QTL定位

分别利用ED和SNP指数两种关联算法对重测序数据进行关联分析。F_8∶9采用△SNP指数法分析后在第1、2和12染色体上共得到4个QTL，第1染色体检测到2个QTL，第2和12染色体分别检测到1个QTL（表4，图3A），采用ED算法结果与△SNP指数法结果一致（图3B）。进一步将F_9∶10进行QTL-Seq分析发现，采用△SNP指数法分析在1~12染色体上均有显著的QTL，而使用ED分析方法分析后，在第1、2、6、7、8、9和11染色体上共得到8个QTL，且这8个QTL存在于采用△SNP指数法分析结果中（表4，图3C、D），第1染色体检测到2个QTL，其中位于36.07~39.87 Mb区间的QTL在两世代的两种关联算法中被重复检测到，因此对该QTL位点进行验证及精细定位。

表4 QTL-Seq 检测到的控制稻米蛋白质含量的QTL区间

Table 4 Grain protein content QTLs detected by QTL-Seq

世代 Generations	染色体 Chromosome	起始（bp） Start	终止（bp） End	△SNP峰值 △SNP peak value	△SNP峰值位置（bp） △SNP peakposition	片段大小（Mb） Size
F_8∶9	1	21547	1975210	0.83	304376	1.9
	1	36072210	39871484	-0.89	38762634	3.6
	2	16395716	19999826	-0.86	19801825	3.6
	12	21143708	24994311	0.77	23162720	3.9
F_9∶10	1	37643035	39609020	-0.96	38974500	1.9
	1	41135157	43226829	-0.95	42529885	2.1
	2	17321	2481618	-0.96	1585992	2.5
	6	21023225	24999963	0.96	21359081	4.0
	7	10000071	14998576	0.97	10572722	5.0
	8	25022875	28433855	0.96	26870574	3.4
	9	9000387	11997888	-0.96	11300356	3.0
	11	24066710	29018426	0.97	26390493	4.9

图3 QTL-Seq 分析结果

Fig. 3 Result of the QTL-Seq analysis

A、C分别是RIL家系F_8∶9和F_9∶10基于SNP/InDel的△SNP-index关联分析，红线代表95%的阈值线，蓝线代表99%的阈值线；B、D分别是RIL家系F_8∶9和F_9∶10基于SNP/InDel的ED关联分析，红线代表99%的阈值线

A， C：△SNP-index association analysis diagram based on SNP/InDel for RIL F_8∶9 and F_9∶10， respectively， the red line indicates the 95% threshold line， the blue line indicates the 99% threshold line； B， D： ED association analysis figures based on SNP/InDel for RIL F_8∶9 and F_9∶10， respectively， the red line indicates the 99% threshold line

2.4 QTL位点的验证及精细定位

利用全基因组重测序数据获得的亲本间基因组差异数据，在第1染色体36.07~39.87 Mb的区间内设计SNP标记，共获得6对有多态的引物（表1）。利用这些多态性SNP标记对RIL群体进行基因型鉴定，通过QTL IciMapping 4.1，构建了控制籽粒蛋白质含量基因的局部遗传连锁图谱，并结合各RIL家系蛋白质含量进行QTL精细定位，最终在第1染色体检测到1个调控籽粒蛋白质含量的QTL，位于标记1-3782~1-3834之间，物理距离为516 kb，表型贡献率和LOD值分别为13.20%和3.91（图4），将其命名为qGPC1。

图4 qGPC1在染色体上的位置及遗传效应

Fig. 4 Location and genetic effect of qGPC1

2.5 候选基因分析及测序验证

通过与Peng 等^［

21］的相关研究结果比较，发现qGPC1位点含有已克隆的籽粒蛋白质含量调控基因qPC1，该基因编码一个假定的氨基酸通透酶OsAAP6，能够正向调控籽粒蛋白质含量，在OsAAP6

的5′UTR区的顺式调控元件中存在两个自然变异可能与籼稻中籽粒蛋白质含量的多样性相关。为检测该基因是否在双亲之间存在差异，本研究对镇粳2400和嘉禾218的OsAAP6基因进行测序，结果发现该基因的5′UTR区已报道的两个自然变异在双亲间无差异（图5A），且该基因的启动子区和编码区在双亲间也未检测到差异（图5A、B），这说明qGPC1位点存在一个新的调控籽粒蛋白质含量的基因。

（图5）

图A中方框代表已报道的变异位点

The boxes in figure A represent the reported mutation sites

图5 亲本的OsAAP6基因启动子区（A）和编码区（B）测序分析

Fig. 5 Sequencing analysis of the promoter region （A） and CDS （B） of OsAAP6 gene in parents

利用重测序数据对双亲在516 kb区间内进行序列比对分析发现，排除发生在基因间、基因上下游、内含子区突变及同义突变，共有12个基因发生SNP或InDel变异，利用水稻表达谱数据库（http：//ricexpro.dna.affrc.go.jp/index.html）对这些基因进行基因功能预测，结果表明这12个基因中有4个为保守假定蛋白基因，1个表达蛋白基因，7个有注释功能的基因（表5）。

表5 定位区间内候选基因及其可能的功能

Table 5 Candidate gene and their putative functions in the location interval

基因 Gene	突变类型 Mutation type	功能注释 Annotation
LOC_Os01g65169	SNP	质子依赖性寡肽转运蛋白
LOC_Os01g65200	SNP	硝酸盐转运蛋白
LOC_Os01g65470	SNP	保守假定蛋白
LOC_Os01g65480	SNP	热激蛋白DnaJ家族蛋白
LOC_Os01g65560	SNP	保守假定蛋白
LOC_Os01g65690	SNP	类4，5-DOPA双加氧酶外二醇蛋白
LOC_Os01g65720	SNP	糖苷水解酶
LOC_Os01g65770	SNP	保守假定蛋白
LOC_Os01g65780	SNP	糖基转移酶
LOC_Os01g65810	SNP	表达蛋白
LOC_Os01g65920	SNP/InDel	富含亮氨酸重复、含半胱氨酸的蛋白
LOC_Os01g66060	SNP	保守假定蛋白

2.6 优异种质镇稻1818的创制

通过前期对RIL各家系农艺性状、稻米食味品质及理化特性调查^［

26］，从RIL家系中筛选出低蛋白含量种质，其与镇稻18号杂交创制出镇稻1818，qGPC1位点来自镇粳2400，因此大米外观与对照品种武运粳23号和南粳5055相比，表现为更透明（图6），镇稻1818株高、结实率和千粒重比两对照显著增加，每穗粒数与南粳5055无显著差异，生育期和每公顷有效穗数与两对照无显著差异（表6）。通过稻米食味品质和理化特性分析发现，镇稻1818的蛋白质含量、垩白粒率和垩白度均显著低于武运粳23号和南粳5055，而米饭食味分、胶稠度和直链淀粉含量均显著高于两对照品种（表7），说明通过降低蛋白质含量可以提高中等直链淀粉含量类型的食味品质，这与前人研究的结果^{［参考文献 3

百度学术}3］一致。

图6 镇稻1818与对照品种大米外观分析

Fig. 6 Rice appearance analysis of Zhendao 1818 and control varieties

表6 镇稻1818与对照品种农艺性状分析

Table 6 The agronomic traits of Zhendao 1818 and control varieties

品种名称

Variety

株高（cm）

Plant height

每公顷有效穗数

（×10⁴）

Effective panicles per hm²

每穗总粒数

Spikelets per panicle

结实率（%）

Seed setting rate

千粒重（g）

Thousand-grain weight

生育期（d）

Growth period

镇稻1818

Zhendao 1818

101.2±0.84^a

325.7±32.58^a

113.6±11.19^b

92.8±2.32^a

26.7±0.21^a

160.8±1.92^a

武运粳23号

Wuyungeng 23

97.6±1.52^b

321.0±20.10^a

135.2±16.75^a

89.8±0.47^b

26.0±0.40^b

159.2±1.30^a

南粳5055

Nangeng 5055

96.0±1.41^b

309.0±24.60^a

130.8±15.22^ab

90.2±0.75^b

24.6±0.29c

159.4±1.67^a

小写字母表示不同品种间差异在P<0.05的显著性水平；下同

Lower case letters indicated the level of significance at P<0.05 of differences between different varieties； The same as below

表7 镇稻1818与对照品种的米饭食味特性及稻米理化指标分析

Table 7 Eating quality of rice and physicochemical indicators of Zhendao1818 and control varieties

品种名称

Variety

米饭食味分

Overall eating quality

垩白粒率（%）

Rate of chalky kernel

垩白度（%）

Chalkiness

蛋白质含量（%）

Protein content

胶稠度（mm）

Gel consistence

直链淀粉含量（%）

Amylose content

镇稻1818

Zhendao 1818

84.85±0.39^a

14.21±0.85^c

3.73±0.22^c

5.63±0.04^c

81.50±0.41^a

17.94±0.25^a

武运粳23号

Wuyungeng 23

79.70±0.65^c

27.63±0.48^b

9.93±0.46^a

6.50±0.04^b

65.63±0.31^c

17.30±0.13^b

南粳5055

Nangeng 5055

82.60±0.25^b

34.60±2.06^a

8.50±1.29^b

7.27±0.06^a

76.33±0.43^b

8.61±0.14^c

3 讨论

光温对稻米蛋白质含量的积累有显著影响，特别是在抽穗至成熟期的有效积温和光照时间对稻米蛋白质含量积累存在显著影响，表现为随有效积温减少蛋白质含量提高^［

27］。本研究中RIL家系的抽穗期变异幅度较大，蛋白质含量与抽穗期呈负相关，抽穗期越早，蛋白质含量越高，但在相同的Hd1和Ehd1基因型内，各家系的蛋白质含量仍表现出多样化，这说明该RIL家系的蛋白质含量存在稳定遗传。

本研究中，利用镇粳2400和嘉禾218的RIL群体，在F_8∶9检测到4个QTL，分别位于第1、2和12染色体， F_9∶10检测到8个QTL，分布于第1、2、6、7、8、9和11染色体上。与前人研究结果相比较，钟明等^［

6］检测到的位于第1染色体的qpc1位于标记RM472~RM104，日本晴中物理距离为37889084~40167060 bp；Wang 等^{［参考文献 7

百度学术}7］检测到一个控制多个氨基酸含量的主效QTL，位于标记RM315~RM104，物理距离为36734135~40167060 bp，这两个QTL与本研究中的位于第1染色体的qGPC1（36072210~39871484 bp）位点属于同一位点，说明该QTL确实存在且稳定遗传。王小雷等^{［参考文献 18

百度学术}18］定位到的位于第12染色体的qPaT12位于分子标记RM3331~RM5479，物理距离为23460827~24379166 bp，与F_8∶9检测到的位于第12染色体的QTL（物理位置21143708~24994311 bp）位点部分重合。杨亚春等^{［参考文献 12

百度学术}12］检测到的控制糙米蛋白质含量的QTL位点qBRPC6.2位于分子标记RM20076~RM3827（物理位置16811995~22297320 bp）与F_9∶10检测到的位于第6染色体的QTL（物理位置21023225~24999963 bp）部分重合。本研究中F_8∶9检测到4个QTL和F_9∶10检测到8个QTL中，只有第1染色体的qGPC1被重复检测到，其他位点均不相同，这说明稻米蛋白质含量的遗传变异受主效基因调控的同时，还受到微效基因和环境因素的影响。有研究表明，蛋白质含量与直链淀粉含量存在相关性^{［参考文献 28

百度学术}28］，本研究中qGPC1靠近垩白基因WCR1^{［参考文献 29

百度学术}29］；F_9∶10检测到的位于第6染色体的QTL靠近Du13基因，Du13基因编码C₂H₂锌指蛋白，通过影响Wx^b的剪接效率进一步调控稻米胚乳中直链淀粉含量^{［参考文献 30

百度学术}30］。F_9∶10检测到的第2染色体QTL与OsBEIIb基因紧密连锁，OsBEIIb基因编码淀粉分支酶IIb，对水稻胚乳中淀粉结构起重要作用^{［参考文献 31

百度学术}31］；F_9∶10检测到的第8染色体QTL与淀粉去分支酶基因OsISA1连锁，ISA1影响淀粉合成和胚乳发育^{［参考文献 32

百度学术}32］，这些结果验证蛋白质含量与淀粉合成相关基因的遗传关系密切，其遗传调控机制需进一步研究。

通过与前人研究结果相比较发现，qGPC1位点含有已克隆的基因OsAAP6/qPC1，该基因编码一个假定的氨基酸通透酶，能够正向调控籽粒蛋白质含量，该基因5′ 端潜在的顺式作用元件的2个自然变异导致了籼稻蛋白质含量的多样性^［

21］。通过对镇粳2400和嘉禾218的OsAAP6基因测序，结果发现该基因的5′ 端已报道的两个自然变异在双亲间无差异，且该基因的编码区和编码区上游2 kb 也未检测到差异，这暗示着该QTL可能存在一个新的基因调控粳稻籽粒蛋白质含量。进一步将qGPC1定位到516 kb区间，通过双亲全基因组重测序分析发现，共有12个基因发生了SNP或InDel变异，其中LOC_Os01g65200编码硝酸盐转运蛋白，该基因过表达会增加水稻叶鞘中的硝酸盐含量和总氮量^{［参考文献 33

百度学术}33］，该基因对籽粒蛋白质含量的调控作用未知，因此候选基因的筛选与功能验证还需进一步的实验证明。此外，本研究利用筛选出的低蛋白质种质做亲本创制的镇稻1818，与生产上大面积推广的对照品种武运粳23号（推广面积66.67×10⁴ hm²以上）和半糯型优质食味品种南粳5055（推广面积133.33×10⁴ hm²以上）相比，表现出更好的食味品质，说明利用低蛋白种质结合分子标记辅助选择可以高效地改良食味品质。

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